豬偽狂犬病病毒的分離鑒定

楊慶芳，寧官保，李俊達(dá)

（1.晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西晉中030600；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷030801；3.武鄉(xiāng)縣畜牧獸醫(yī)中心，山西武鄉(xiāng)046300）

2008年2月以來，山西多個規(guī)?；i場出現(xiàn)妊娠母豬流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎和產(chǎn)弱仔，初生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，給生產(chǎn)造成巨大損失。為查明引起該疫病發(fā)生的根本原因，我們采集了病死豬的腦、肺、肝、脾、腎等組織病料，對其進(jìn)行了研磨與過濾處理，并對其病原菌進(jìn)行了分離。最終從病死仔豬的腦、肺、肝組織病料中分離出1株疑似偽狂犬病病毒（PRV）的毒株，并對其進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 倉鼠腎傳代細(xì)胞（BHK-21），購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 血清 豬偽狂犬病中和試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；陰性豬血清，采自規(guī)模豬場非免疫健康豬，經(jīng)gE鑒別ELISA診斷試劑盒檢測均為陰性。

1.1.3 病料 無菌采集病死仔豬、流產(chǎn)胎兒的腦、肺、肝、脾、腎等組織置-70℃保存，供分離病毒用。用前將上述組織混合在一起于滅菌過的研缽內(nèi)剪碎，用組織研磨器研磨，加入含青霉素、鏈霉素（終濃度各1 000單位/mL）的Hank’s液制成1∶5乳劑，置15 mL的離心管中反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心30 min，取病料上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，-70℃保存作為接種材料。

1.1.4 試劑 （1）DMEM培養(yǎng)基，Gibco12100-046，購自華美生物工程公司；（2）新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；（3）青霉素160萬單位，鏈霉素100萬單位，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；（4）Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL），4 dNTP 混合液（各 2.5 mmol/L），DL2 000 DNA Marker，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；（5）胰酶，蛋白酶 K，EDTA，Tris液，SDS，瓊脂糖，生工生物工程（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮中取出裝有BHK-21細(xì)胞的凍存管，迅速放入37～40℃溫水中，同時不斷晃動，使凍存細(xì)胞盡快融化，在超凈工作臺中無菌打開凍存管，用吸管把凍存液緩慢加入放有10 mL無血清的DMEM離心管中，800 r/min離心10 min，吸去上清，用含10%血清DMEM懸浮細(xì)胞，加入細(xì)胞瓶中再加7 mL生長液，復(fù)蘇。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并檢測細(xì)胞活力。置于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，待生長正常后進(jìn)行試驗(yàn)（一般在48 h左右長成單層）[1]。

1.2.1.2 細(xì)胞凍存 選取生長良好的細(xì)胞瓶，棄去培養(yǎng)液，加入1 mL左右的消化液（25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶），靜置，待細(xì)胞之間出現(xiàn)小裂隙時，棄去消化液，加入3 mL無血清的DMEM培養(yǎng)基，用吸管吹打使細(xì)胞散開，吸15 mL到離心管中，800 r/min離心10 min，棄上清，用3 mL凍存液輕輕吹開細(xì)胞，移入凍存管中，緩慢凍存于4℃0.5 h，-20℃2 h，-80℃過夜，第2天放入液氮中凍存。

1.2.2 病毒的增殖 當(dāng)BHK-21細(xì)胞鋪滿單層時，按10%的量接種處理好的病料，每份接種2瓶，并設(shè)2瓶正常為對照。37℃溫箱中吸附2 h，期間每隔30 min晃動接種的培養(yǎng)瓶，使接種液和細(xì)胞充分接觸。孵育2 h后，傾去接種液，加入8 mL含2%血清的維持液。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變（2～3次/d），待細(xì)胞病變達(dá)80%時，收獲病毒，-20℃保存?zhèn)溆?。若?次接種不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則將細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，4℃，1 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，盲傳3代，有細(xì)胞病變者繼續(xù)傳代，直至第4代，收取細(xì)胞瓶，反復(fù)凍融3次，經(jīng)3000r/min離心10min，收獲上清液作為種毒于-70℃保存。

1.2.3 病毒的毒價測定 取種毒100 μL用維持液900 μL連續(xù)做10倍稀釋，從10-4稀釋到10-11，接種于長成單層的96孔培養(yǎng)板，每稀釋度8孔，每孔100 μL，同時設(shè)2組細(xì)胞對照，37℃，5%CO2培養(yǎng)。連續(xù)觀察5 d，記錄結(jié)果，按Karber法計算毒株的TCID50。

1.2.4 病毒的鑒定

1.2.4.1 病毒的中和試驗(yàn) 采用固定病毒稀釋血清法，將偽狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用50 μL無血清的DMEM作倍比稀釋，從20到29，分別與50 μL含200個TCID50的分離病毒液混勻，置37℃作用1.5 h，接種于長成單層的96孔培養(yǎng)板，每個稀釋度8孔，每孔100 μL，并設(shè)陽性血清和正常細(xì)胞作為對照。5%CO2，37℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察5 d，按Reed-Muench法計算血清中和效價[2]。

1.2.4.2 病毒PCR鑒定

（1）引物的設(shè)計與合成。運(yùn)用Primer premier 5.0軟件，參考Genbank上已發(fā)表的PRV序列，針對PRV的保守序列設(shè)計1對引物，擴(kuò)增片段為237 bp。上游引物：5′-CACGGAGGACGAGC TGGGGCT-3′，下游引物：5′-GTCCACGCCCC GCTTGAAGCT-3′。

引物由南京金思特科技有限公司合成。使用前，用高壓滅菌超凈水溶解，濃度20 pmol/μL，置于-20℃保存?zhèn)溆肹3]。

（2）病毒核酸的提取。取病毒液SX09及陰性對照各500 μL，加入10%SDS、蛋白酶K至終濃度分別為0.5%和50 μg/mL，水浴2 h。用等體積的苯酚、苯酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提1次，取上清。向上清液中加入1/10體積的3 mol/L NaAc（pH值為5.2）和等體積的異丙醇，室溫放置30 min，4 ℃ 13 000 r/min 離心 15 min，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，待干燥后，用30 μL滅菌水溶解DNA沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）PCR 鑒定。反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，上下游引物各 10 pmoL，DNA模版 2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，加 ddH2O至 25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物鑒定：取7 μL PCR產(chǎn)物，加2 μL 6×Loding buffer混勻后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞病變觀察

病料SX09接種BHK-21細(xì)胞，盲傳4代。36 h后，細(xì)胞開始收縮、變圓，聚攏（圖1-A）。細(xì)胞層形成空洞狀病變，至70 h可見成片脫落（圖1-B）；對照細(xì)胞沒有變化，正常（CK）（圖 1-C）。

2.2 分離病毒的TCID50

對分離的PRV SX09毒株接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行毒價測定，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 PRV病毒滴度的測定

將試驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)代入Karber法計算公式lgTCID50＝L＋d（S－0.5）（其中，L 為最低稀釋度的對數(shù)，為-4；d為稀釋系數(shù)，10倍遞進(jìn)稀釋時，d為-1；S為死亡比值之和，即各組感染數(shù)/試驗(yàn)數(shù)的相加）。根據(jù)此公式計算該病毒的TCID50分別為 10-8.0/0.1 mL，10-8.125/0.1 mL，10-8.0/0.1 mL，得平均值為10-8.042/0.1 mL。

2.3 中和試驗(yàn)

PRVSX09與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。根據(jù)Reed-Muench法計算，病毒分離株的200個TCID50能被標(biāo)準(zhǔn)陽性血清10-1.93所中和，表明病毒分離株具有PRV的抗原性。

表2 PRV SX09與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和試驗(yàn)

2.4 PCR鑒定產(chǎn)物電泳結(jié)果

用從SX09病毒液中提取的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DL2 000 DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增出的特異性片段，與預(yù)期的大小一致，模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小近似237 bp（圖2）。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報道[4]，PRV可在多種動物細(xì)胞中生長繁殖，如在豬腎細(xì)胞、兔腎細(xì)胞、牛睪丸細(xì)胞等原代細(xì)胞以及PK-15，Vero，BHK-21等傳代細(xì)胞中都能很好地增殖。本試驗(yàn)充分驗(yàn)證了PRV可在BHK-21細(xì)胞上增殖，并出現(xiàn)典型的皰疹病毒的細(xì)胞病變，毒價（TCID50）為 10-8.042/0.1 mL；病毒能被PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和；用PCR方法鑒定分離的病毒液為PRV陽性；以上結(jié)果表明所分離的病毒株為偽狂犬病病毒。并命名為SX09株。

查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，偽狂犬病病毒株間毒力存在差異[5]。在本試驗(yàn)中，以微量法測得分離病毒株在BHK-21細(xì)胞上的TCID50為10-8.042/0.1 mL，與國內(nèi)其他分離毒株相比，病毒毒力較強(qiáng)。另外，分離病毒株能被PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和，這與目前各國學(xué)者認(rèn)為的PRV僅有一個血清型相吻合[6]。

在對SX09株進(jìn)行TCID50測定時發(fā)現(xiàn)，病毒液在最大稀釋倍數(shù)時，沒有任何一孔發(fā)生細(xì)胞病變，而在最小稀釋倍數(shù)時，8孔細(xì)胞全部出現(xiàn)細(xì)胞病變，說明該試驗(yàn)是成立的且試驗(yàn)結(jié)果可信；中和試驗(yàn)的過程中，血清在最小稀釋倍數(shù)時，沒有任何一孔發(fā)生細(xì)胞病變，而在最大稀釋倍數(shù)時，8孔細(xì)胞全部出現(xiàn)細(xì)胞病變，說明該試驗(yàn)仍然是成立的且試驗(yàn)結(jié)果可信。

本試驗(yàn)首次對山西省豬偽狂犬病病毒進(jìn)行了分離鑒定，填補(bǔ)了山西在此方面研究的空白，也為今后開展該病的診斷和防治研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］Maes R K，Sussman MD.Recent develop-ments in latency and recombination ofPRV[J].Vet Microbiol，1997，55：13-27．

［2］李學(xué)伍，陳煥春.PCR法對偽狂犬病病豬不同部位的檢測及敏感性試驗(yàn)[J].中國畜禽傳染病，1998，20（6）：365-368.

［3］陳陸，查光明，王川慶，等.偽狂犬病病毒gE/gB PCR鑒別方法的建立及其應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科技，2005，35（5）：346-348.

［4］方萬榮，陳煥春，何啟蓋，等.應(yīng)用微量中和試驗(yàn)進(jìn)行豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查[J].中國畜禽傳染病，1998，20（3）：24-26.

［5］ Talmagc T B，Kwang O S，F(xiàn)rcdcrick J F.Dctcction of PR Viral DNAin tonsillar epithelial cells oflatecntiyinfected pigs[J].Am J Vet Res，1995，56（5）：587-594．

［6］Cheung A K.Investigation of PRV DNA and RNA in trigeminal ganglia tonsil tissues of latentlyinfected swine[J].AmJ Vet Res，1995，56（1）：45-50.