雙花提取物抗糖尿病的作用研究

巫冠中，馮 玥

（中國(guó)藥科大學(xué) 藥理教研室，江蘇 南京210009）

糖尿?。―iabetes Mellitus）是一種多病因的代謝疾病，以慢性高血糖為主要特征，伴隨因胰島素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。其中以2型糖尿病最為常見，占糖尿病人總數(shù)的90%以上［1］。糖尿病常引起心血管病變、視網(wǎng)膜病變等多種并發(fā)癥，死亡率逐年上升［2］，因此研發(fā)有效防治糖尿病及其并發(fā)癥的藥物成為人們的迫切需求。中藥防治糖尿病有悠久的歷史，近年來已分離出許多藥效良好的活性成分，黃酮類化合物已被證實(shí)具有降低血糖、血脂，改善糖耐量等作用［3］，而月季花（Rosa chinensis）和玫瑰花（Rosa rugosa）含有多種黃酮類物質(zhì)［4－5］，具有抗氧化［6］、降糖［7］及減肥作用等［8］。基于月季和玫瑰的藥理作用，將這兩種同屬薔薇科的植物按比例混合，利用體內(nèi)外試驗(yàn)綜合觀察其對(duì)糖尿病糖、脂代謝的調(diào)控作用，并探究可能的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物及飼料

清潔級(jí)SD大鼠，雄性，160～180g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中 心，合 格 證 號(hào)：SCXK（蘇 ）2008－0033；飼 養(yǎng) 溫 度（22±2）℃，照明時(shí)間12h／d。普通飼料（南京市青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)），高脂飼料由70%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、10%蔗糖、10%全蛋粉混合加工而成，由青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)制作。

1.2 雙花提取物

月季花和玫瑰花購(gòu)自安徽神州醫(yī)藥公司，15℃～20℃自然晾干，兩種花等比例混合后80℃水提2次，第一次料液比1∶12，60min；第二次料液比1∶8，30min。提取液經(jīng)DM301大孔樹脂吸附純化后，用40%乙醇洗脫，洗脫物75℃真空干燥得最終雙花提取物。測(cè)得提取物總黃酮含量約45%～51%，經(jīng)HPLC檢測(cè)主要含柚皮素、紫云英苷、槲皮素等黃酮類物質(zhì)。

1.3 儀器和設(shè)備

752N分光光度儀（上海菁華科技）；LS－1F型超凈工作臺(tái)（上海索普儀器）；YCP－200型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海易亮醫(yī)療器械）；XDS－1B倒置顯微鏡（OlymPus）；放射免疫γ計(jì)數(shù)器（DFM－96型16管手動(dòng)）。

1.4 藥品及試劑

吡格列酮、格列美脲（上海蘭生股份有限公司），STZ（Sigma）；葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白試劑盒（上?？菩郎锛夹g(shù)研究所）；胰島素、胰高血糖素試劑盒（中生北控生物技術(shù)有限公司）；糖化血清蛋白、丙二醛試劑盒（南京建成生物工程研究所）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco），HEPES（Merk），胰蛋白酶（1∶250）（AMRESCO），96孔培養(yǎng)板（Costar），小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），其他試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立

參照文獻(xiàn)［9－10］設(shè)計(jì)，略有改進(jìn)。SD大鼠65只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后按體重隨機(jī)分為7組，一組為正常對(duì)照組（n＝9），常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余6組喂高脂飼料，誘導(dǎo)胰島素抵抗。4周后，將高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠禁食12h，腹腔注射用檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液新鮮配制的STZ（劑量35mg／kg，體積0.2mL／100g），5天后禁食12h監(jiān)測(cè)空腹血糖，次日第二次腹腔注射同劑量STZ。第二次注射STZ 5天后，測(cè)各組空腹血糖，血糖值大于11.1mmol／L視為造模成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功的52只大鼠，按血糖值隨機(jī)分為6組，模型對(duì)照組9只，雙花提取物高、中、低劑量組（分別為50mg／kg、25mg／kg、12.5mg／kg）各9只，吡格列酮組（10mg／kg）、格列美脲組（10mg／kg）各8只。各組藥物均用0.1%CMCNa混懸，每天一次灌胃給藥，共給藥5周。除正常對(duì)照組外，其他各組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

2.3 口服糖耐量（OGTT）的測(cè)定

各組灌胃給藥2周后禁食12h，按各自劑量灌胃給藥的同時(shí)灌胃2g／kg葡萄糖，分別在給藥前（0h）及給藥后0.5h，1h，2h，4h眼眶采血，分離血清后用葡萄糖試劑盒測(cè)定血糖值。

2.4 血清中各指標(biāo)的測(cè)定

各組連續(xù)灌胃給藥5周，末次給藥后禁食12h，麻醉后股靜脈放血并處死，分離血清同時(shí)取心臟、肝臟和腎臟，－20℃保存待測(cè)。血清中 TC，TG，HDL－C，LDL－C，F(xiàn)BG，GSP，Ins，Glu含量均用試劑盒測(cè)定，其中胰島素及胰高血糖素用放免法測(cè)定。

2.5 各臟器MDA的測(cè)定

各組心臟、肝臟和腎臟室溫解凍后，稱取0.2g用冰冷生理鹽水沖洗，剪碎加入生理鹽水冰水浴勻漿制備勻漿液，4 000r／min離心10min，取上清液測(cè)MDA。

2.6 HePG2葡萄糖消耗的測(cè)定

2.6.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HePG2購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所，接種于含10%小牛血清的中糖DMEM培養(yǎng)基中（含葡萄糖11.1 mmol／L，補(bǔ)充青霉素、鏈霉素各100U／L），置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HePG2細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，0.25%胰酶消化，每3天按1∶3的比例傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞懸液以1.5×105的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使之形成單層貼壁細(xì)胞。

2.6.2 葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)

接種24h后細(xì)胞已完全貼壁形成單層細(xì)胞層，吸掉培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次，然后各孔加入終濃度為0.022mg／mL、0.067mg／mL、0.200mg／mL、0.600mg／mL的雙花提取物（不同質(zhì)量的提取物溶解在含11.1mmol／L葡萄糖的DMEM中過濾而成），同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照組和無細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)照組（即空白孔）。在培養(yǎng)箱中孵育24h后將培養(yǎng)液移出用葡萄糖試劑盒測(cè)葡萄糖含量。用各組空白孔含糖量的平均值減去其余各孔的含糖量，即是24h各孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量。板中下層細(xì)胞用200g／L KOH裂解，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 提取物對(duì)2型糖尿病大鼠口服糖耐量（OGTT）的影響

由表1可見，各組血糖峰值出現(xiàn)在糖負(fù)荷后1h，模型組各時(shí)間點(diǎn)的血糖值較正常組都有顯著提高（P＜0.01），可見糖耐量嚴(yán)重受損。提取物高、中劑量組與模型組比較，可顯著降低糖負(fù)荷后的血糖峰值（P＜0.05），顯著縮小曲線下面積AUC（P＜0.01，P＜0.05），改善糖負(fù)荷后的血糖波動(dòng)，作用優(yōu)于陽(yáng)性藥。

3.2 提取物對(duì)2型糖尿病大鼠血清TC，TG，HDL－C，LDL－C的影響

高脂飼料喂養(yǎng)并灌胃給藥5周后，模型組TC，TG，HDL－C，LDL－C水平明顯高于正常對(duì)照及其他給藥組（見表2），其中提取物高劑量組可顯著降低TC，TG，LDL－C（P＜0.01），與陽(yáng)性藥作用相近，同時(shí)顯著升高 HDL－C（P＜0.01），此方面作用強(qiáng)于陽(yáng)性藥。提取物中、低劑量作用減弱，體現(xiàn)了劑量相關(guān)性。

表1 雙花提取物對(duì)2型糖尿病大鼠口服糖耐量（OGTT）的影響（s）

表1 雙花提取物對(duì)2型糖尿病大鼠口服糖耐量（OGTT）的影響（s）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量（mg／kg）n 灌胃給藥后時(shí)間（h）0 0.5 1 2 4 AUC（mM×h）正常組 9 5.13±1.07 6.08±1.33 7.32±1.94 5.72±1.09 4.11.91±2.49 77.92±7.28 94±1.34 23.34±4.00模型組 9 13.52±2.51＃＃ 27.62±2.86＃＃ 30.74±3.45＃＃ 26.38±2.42＃＃ 14.11±2.75＃＃ 93.92±9.70＃?；ǜ呓M 50 9 10.87±1.97 20.40±2.67＊ 23.27±2.33＊ 18.75±2.93＊＊ 10.62±2.56 69.11±5.96＊＊花中組 25 9 11.76±2.35 22.45±2.39＊ 24.42±2.79＊ 19.98±2.58＊ 11.34±2.25 73.79±3.58＊花低組 12.5 9 10.94±2.77 24.87±2.62 28.22±3.27 22.64±2.41 11.23±2.62 81.52±10.52匹格列酮 10 8 11.64±2.4 22.38±2.38＊ 25.35±3.05 20.00±2.52＊ 9.95±2.41 73.06±7.10＊格列美脲 10 8 11.48±2.04 23.86±2.46 26.94±2.91 20.68±2.47＊

表2 雙花提取物對(duì)2型糖尿病大鼠血脂各項(xiàng)的影響（s）

表2 雙花提取物對(duì)2型糖尿病大鼠血脂各項(xiàng)的影響（s）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量（mg／kg）TC（mM）TG（mM）HDL－C（mM）LDL－C（mM）正常組 1.73±0.33 0.65±0.28 1.43±0.22 0.21±0.08模型組 2.75±0.32＃＃1.16±0.29＃＃1.29±0.24 1.38±0.39＃?；ǜ呓M 50 2.31±0.3＊＊ 0.75±0.07＊＊1.84±0.31＊＊0.38±0.12＊＊花中組 25 2.43±0.27＊ 0.93±0.28 1.79±0.33＊＊0.47±0.19＊花低組 12.5 2.5±0.32 0.99±0.24 1.68±0.33＊ 0.71±0.22匹格列酮 10 2.01±0.37＊＊0.79±0.34＊ 1.58±0.29＊ 0.39±0.17＊格列美脲 10 1.9±0.35＊＊ 0.82±0.14＊ 1.49±0.25 0.36±0.10＊＊

3.3 提取物對(duì)2型糖尿病大鼠血清FBG，GSP，Ins，Glu的影響

表3可見，與模型組比較提取物可顯著降低糖尿病大鼠FBG、GSP，并呈現(xiàn)劑量相關(guān)性；模型組Ins、Glu較正常組顯著升高（P＜0.01），說明胰島素抵抗已形成，提取物高、中劑量能顯著降低血清中Ins、Glu（P＜0.01，P＜0.05），其中高劑量與陽(yáng)性藥比較無顯著性差異。

表3 雙花提取物對(duì)2型糖尿病大鼠血清各指標(biāo)的影響（s）

表3 雙花提取物對(duì)2型糖尿病大鼠血清各指標(biāo)的影響（s）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

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3.4 提取物對(duì)2型糖尿病大鼠各臟器MDA的影響

由表4可見，提取物及陽(yáng)性藥降低MDA的作用只在腎臟較為顯著，肝臟及心臟MDA值也略有下降，但與模型組比較無顯著性差異。

3.5 提取物對(duì)HePG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

圖1顯示，提取物可顯著增加HePG2細(xì)胞葡萄糖消耗量，并呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，與不含藥的對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.01）。

表4 雙花提取物對(duì)2型糖尿病大鼠各臟器MDA的影響（s）

表4 雙花提取物對(duì)2型糖尿病大鼠各臟器MDA的影響（s）

注：與正常組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量2.18±0.39（mg／kg）n MDA（nmol／mg Pro）9 1.78±0.26 1.23±0.16 1.84±0.22模型組 9 2.38±0.34＃ 2.02±0.35＃＃ 2.3±0.33?；ǜ呓M 50 9 2.15±0.21 1.49±0.29＊ 2.19±0.3花中組 25 9 2.42±0.33 1.58±0.26＊ 2.33±0.22花低組 12.5 9 2.65±0.36 1.73±0.25 2.45±0.23匹格列酮 10 8 2.17±0.28 1.58±0.38＊ 2.17±0.33格列美脲 10 8 2.13±0.2 1.42±0.25＊＊肝臟 腎臟 心臟正常組

圖1 雙花提取物對(duì)HepG2葡萄糖消耗的影響

4 討論

2型糖尿病除先天因素外，后天不合理的飲食習(xí)慣是重要的誘因之一，常并發(fā)血脂代謝異常。而胰島素與其受體結(jié)合所產(chǎn)生的一系列反應(yīng)是調(diào)節(jié)脂代謝的重要因素［11］，當(dāng)胰島素分泌障礙或功能性障礙均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)脂代謝異常，引發(fā)多種物質(zhì)代謝異常的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙花提取物可顯著降低FBG，改善葡萄糖耐量，使糖負(fù)荷的血糖峰值顯著降低，曲線下面積減小，從而抑制血糖波動(dòng)。而餐后血糖的較大波動(dòng)是引起糖尿病并發(fā)癥的重要原因［12］，由此可見，雙花提取物對(duì)預(yù)防糖尿病并發(fā)癥有益。GSP作為糖尿病近期內(nèi)控制的一個(gè)靈敏指標(biāo)，可反應(yīng)2～3周前的血糖控制水平［13］。雙花提取物可顯著降低GSP，與陽(yáng)性藥作用相當(dāng)，且顯著降低 TG，TC，LDL－C，對(duì)升高 HDL－C的作用尤為顯著，從而改善脂質(zhì)代謝紊亂。本試驗(yàn)還表明，雙花提取物的確可顯著鵪鶉高脂誘導(dǎo)的大動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（數(shù)據(jù)未列出）。胰島素抵抗階段，胰島β細(xì)胞通過增加胰島素的分泌使血糖維持在較低水平，可表現(xiàn)為胰島素水平的升高。相對(duì)于模型組大鼠胰島素水平，雙花提取物組胰島素和胰高血糖素水平均較低，表明它通過調(diào)節(jié)兩種激素的分泌控制血糖。糖尿病引起體內(nèi)不同程度的氧化損傷，MDA作為氧自由基作用于脂質(zhì)產(chǎn)物，反應(yīng)氧自由基在體內(nèi)的損傷程度。除腎臟外，雙花提取物對(duì)糖尿病大鼠其它臟器MDA的影響較小，抗氧化作用較弱。雙花提取物顯著增加HePG2葡萄糖消耗量，增加肝臟對(duì)葡萄糖的利用而降低血糖。由此，雙花提取物抗糖尿病作用可能與以下因素有關(guān)：①改善糖耐量，降低血胰島素和胰高血糖素，從而改善胰島素抵抗，減小餐后血糖波動(dòng)；②增加肝臟對(duì)糖的消耗利用，減少肝糖的輸出；③降低TG，TC，LDL－C，升高 HDL－C，從而改善脂代謝紊亂，抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。

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