豫南地區(qū)漢族人群類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者TNF-α基因啟動(dòng)子－308 G/A多態(tài)性檢測(cè)*

宋新強(qiáng)，汪學(xué)群，易朝輝，鄭 健，韓俊剛，劉承麗，張亞可，彭玉玲，馬 云

1)信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院信陽464000 2)信陽市第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科信陽464000 3)信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院信陽464000

(2010-11-28收稿 責(zé)任編輯 趙秋民)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，遺傳和環(huán)境因素都有可能導(dǎo)致該病的發(fā)生與發(fā)展［1］。一部分遺傳因素來自于人類主要組織相容性復(fù)合體(HLA)Ⅱ類基因，也有研究［2］表明，HLAⅢ類基因的一些區(qū)域也與RA的易感性有關(guān)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)基因位于 HLAⅢ類基因區(qū)，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，含有許多多態(tài)性位點(diǎn)，包括微衛(wèi)星DNA和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有 14個(gè) SNP位點(diǎn)(－1031 T/C，－863 C/A，－857 C/T，－851 C/T，－419 G/C，－376 G/A，－308 G/A，－244 G/A，－238 G/A，－163 G/A，－49 G/A，+489 G/A，+851 A/G，+1304 A/G)和6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)［3］。目前，已有關(guān)于TNF-α基因SNPs與RA的相關(guān)性研究，但是，很多結(jié)論卻完全相反［4-7］。作者以豫南地區(qū)人群作為研究對(duì)象，分析TNF-α基因啟動(dòng)子－308 G/A多態(tài)性與RA發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 RA組90例，其中女60例，男30例，均為漢族，年齡 18 ～75(33.5 ±3.2)歲，為信陽市第一人民醫(yī)院2008年至2010年住院及門診確診的患者，病程5個(gè)月～15 a。診斷符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)1987年診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中無侵蝕性病變者32例，有侵蝕性病變者58例。正常對(duì)照100例，女60例，男40例，均為漢族，年齡18～60(34.2±4.6)歲，為信陽師范學(xué)院校醫(yī)院門診體檢健康者。

1.2 標(biāo)本采集及基因組DNA的提取 抽取受試者外周血2 mL，加EDTA抗凝后－20℃冰凍保存。用酚/氯仿抽提法提取基因組 DNA，其 A(260nm)/A(280nm)為1.6 ～1.8，使用時(shí) DNA 終質(zhì)量濃度為100～300 μg/L。

1.3 TNF-α－308 G/A 的PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析 根據(jù)文獻(xiàn)［8］設(shè)計(jì)引物，上游引物序列:5’-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3’，下游引物序列:5’-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3’。PCR反應(yīng)體系(50μL):10×PCR Buffer 5μL，dNTPs 4 μL，Taq 酶 0.25 μL，模板 DNA 8 μL，引物各1μL，雙蒸水30.75μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸50 s，循環(huán)30次;72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物13 μL，加10×Buffer 2 μL，NcoⅠ酶1 μL，100 mg/L牛血清白蛋白2μL，雙蒸水2μL，總體積20μL，37℃過夜(12 h)。酶切產(chǎn)物采用25 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用凝膠分析系統(tǒng)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，應(yīng)用χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)檢測(cè)RA組與對(duì)照組基因型頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。用χ2檢驗(yàn)、精確概率法或校正χ2檢驗(yàn)比較2組基因型頻率和等位基因頻率以及有無侵蝕性病變患者等位基因的分布，并以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(CI)表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 正常對(duì)照組TNF-α 基因啟動(dòng)子(χ2=6.750，P=0.009)和 RA 組－308 位點(diǎn)(χ2=19.401，P ＜0.001)基因型頻率均不符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2 TNF-α基因啟動(dòng)子 －308 G/A PCR-RFLP 結(jié)果 TNF-α基因啟動(dòng)子－308位點(diǎn)檢出3種基因型，酶切產(chǎn)物分別包含87、20 bp 2條條帶GG型，107、87、20 bp 3條條帶(GA型)和僅有107 bp條帶(AA型)。見圖1。2組基因型及等位基因頻率的比較見表1。RA組有、無侵蝕性病變患者間TNF-α基因啟動(dòng)子－308位點(diǎn)等位基因頻率比較，見表2。

圖1 NcoⅠ酶切 TNF-α基因啟動(dòng)子－308位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1，4:GA型;2:GG型;3:AA型。

表1 RA組與正常對(duì)照組TNF-α基因啟動(dòng)子－308位點(diǎn)基因型和等位基因頻率 例(%)

表2 RA組有、無侵蝕性病變患者TNF-α基因啟動(dòng)子－308位點(diǎn)等位基因頻率分布 例(%)

3 討論

實(shí)驗(yàn)［9］表明，在RA患者血清和滑膜液中都能檢測(cè)到TNF-α與白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-13、IL-15、IL-17、TGF-β 等，提示細(xì)胞因子參與了RA的發(fā)病過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［10-11］也暗示，TNF-α的高表達(dá)加快了RA的發(fā)病過程。

有研究［4］結(jié)果顯示RA的易感性與TNF-α啟動(dòng)子－308位點(diǎn)A等位基因有關(guān)，另有研究［5］顯示RA與G等位基因有關(guān)，或者兩者都與RA無關(guān)［6-7］。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示豫南地區(qū)漢族人群TNF-α基因啟動(dòng)子－308位點(diǎn)G/A多態(tài)性與RA發(fā)病無關(guān)，但與RA的疾病發(fā)展程度相關(guān)。Cvetkovic等［9］的實(shí)驗(yàn)表明，在伊朗東北部城市麥?zhǔn)驳?，TNF-α基因啟動(dòng)子－308位點(diǎn)GA雜合子患者更易發(fā)生RA;Wilson等［4］的實(shí)驗(yàn)也表明，在荷蘭的奈梅亨GA基因型更易發(fā)展為侵蝕型RA;而Brinkman等［5］報(bào)道稱，在荷蘭西部城市萊頓未發(fā)現(xiàn)－308位點(diǎn)GA型與RA的疾病發(fā)展程度相關(guān)，卻發(fā)現(xiàn)－238 GG型與RA疾病發(fā)展程度相關(guān)。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α基因啟動(dòng)子－308位點(diǎn)G等位基因與RA的嚴(yán)重程度有關(guān)。

綜上所述，TNF-α基因啟動(dòng)子－308 G/A多態(tài)性可能與豫南地區(qū)漢族人群RA無關(guān)，但可能與關(guān)節(jié)的侵蝕性病變有關(guān)。

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