重組人生長激素對人巨噬細(xì)胞分泌IL-1、IL-6和TNF-α的影響*

丁培杰，段長恩，張世杰，趙國強(qiáng)

1)漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校免疫學(xué)教研室漯河462000 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室新鄉(xiāng)453003 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科鄭州450052 4)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州450001

(2010-06-11收稿 責(zé)任編輯 徐春燕)

生長激素(growth hormone，GH)是由腦垂體前葉的腺細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，其主要作用是促進(jìn)生長發(fā)育和影響代謝，既往主要用于兒童GH缺乏癥的治療。近年來發(fā)現(xiàn)GH具有廣泛的生理作用，其免疫調(diào)節(jié)作用為人們廣泛關(guān)注［1］。已有研究［2-3］顯示GH對T淋巴細(xì)胞有重要的調(diào)節(jié)作用。作者從人靜脈血中分離單個核細(xì)胞，將其誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，觀察不同質(zhì)量濃度的人重組GH(rhGH)對于人巨噬細(xì)胞分泌IL-1、IL-6和TNF-α的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(天津TBD公司)，重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rh-GM-CSF，Peprotech 公司)，CD14-FITC、TLR4-PE 及同型對照(深圳晶美生物工程有限公司)，脂多糖(LPS，上海BOYUN公司)。

1.2 巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)與鑒定［4］取健康人靜脈血，肝素抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞。用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(含終濃度1 000 U/mL rhGM-CSF)培養(yǎng)6 d。觀察貼壁細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD14和TLR4的表達(dá)。

1.3 細(xì)胞分組與處理 將1.2中所獲得的細(xì)胞分為6組，分別加入終質(zhì)量濃度為1、4、20和50μg/L的rhGH，LPS組加入的終質(zhì)量濃度為1 mg/L的LPS，空白對照組僅給予RPMI 1640培養(yǎng)液。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、IL-6和TNF-α水平測定 于培養(yǎng)4、8、12 h分別吸取培養(yǎng)上清液50 μL，以ELISA法測定各培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-1和TNF-α的水平(每組的不同時間點均設(shè)3個復(fù)孔)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，應(yīng)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析觀察6組細(xì)胞培養(yǎng)不同時間培養(yǎng)上清液中IL-1、IL-6和TNF-α水平的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞的鑒定 顯微鏡下觀察細(xì)胞，可見貼壁細(xì)胞伸展，牢固黏附，體積明顯增大，從不規(guī)則形逐漸變成橢圓形，呈煎蛋狀，少數(shù)呈長梭形。細(xì)胞間可有部分融合，細(xì)胞周邊或兩極可見板狀偽足和突起，細(xì)胞無明顯增殖。所誘導(dǎo)的細(xì)胞較為一致地表達(dá)CD14和TLR4，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示 CD14和TLR4的細(xì)胞陽性率達(dá)85.1%。

2.2 6組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 IL-1、IL-6和TNF-α水平比較 見表1。

表1 6組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、IL-6和TNF-α水平比較(n=3)

3 討論

該研究選用人外周血單個核細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞的來源，與動物實驗相比更接近人體功能。單個核細(xì)胞具有不同的分化潛能，在不同的培養(yǎng)條件下可向巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞分化。GM-CSF在體外可誘導(dǎo)單個核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞［5-6］。巨噬細(xì)胞的鑒定指標(biāo)主要包括形態(tài)學(xué)檢查、生物學(xué)功能檢查和免疫學(xué)標(biāo)志檢查等。CD14和TLR4是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)特征性的表面標(biāo)記。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示CD14和TLR4的細(xì)胞陽性率為85.1%，證明該法培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞在體外具有生物學(xué)活性，且純度較高。

rhGH是近年來利用重組DNA技術(shù)合成的GH，已在臨床上得到廣泛應(yīng)用，其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，在體內(nèi)和體外均能促進(jìn)胸腺基質(zhì)細(xì)胞分泌胸腺素［7］，在體外能促進(jìn)植物血凝素刺激的正常人T淋巴細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)能提高自然殺傷細(xì)胞的活性［8］。

LPS是公認(rèn)的體內(nèi)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子的始動者，可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌增加［9］。該研究結(jié)果顯示LPS刺激巨噬細(xì)胞可以顯著升高IL-1、IL-6及TNF-α等促炎癥細(xì)胞因子的分泌，其機(jī)制應(yīng)該與LPS和巨噬細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使細(xì)胞因子的分泌增加有關(guān)［10］。rhGH同樣可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞上述細(xì)胞因子的分泌，且隨培養(yǎng)時間的延長呈升高的趨勢，可視為宿主對外來病原體的一種防御反應(yīng);當(dāng)達(dá)到一定質(zhì)量濃度后其巨噬細(xì)胞的分泌便不再增加，其機(jī)制可能為GH與巨噬細(xì)胞表面的GH受體結(jié)合而激活細(xì)胞內(nèi)的某些轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而誘導(dǎo)其細(xì)胞因子的分泌，但當(dāng)GH達(dá)到一定質(zhì)量濃度后，由于與細(xì)胞表面受體結(jié)合飽和以及胞內(nèi)相關(guān)信號途徑均已激活而不再增加。

總之，作者利用人外周血分離和培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)GH具有與LPS相似的促進(jìn)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的作用，說明GH可能參與免疫調(diào)節(jié)作用，然而GH如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的這種功尚需要進(jìn)一步研究。

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