利用同步輻射X射線衍射研究家蠶的紡絲過程

黃 燕，張耀鵬，羅 杰，邵惠麗，胡學(xué)超

（東華大學(xué) 纖維材料改性國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，材料科學(xué)與工程學(xué)院，化學(xué)纖維研究所，上海 201620）

蠶絲具有質(zhì)輕細(xì)長、光澤獨(dú)特、手感優(yōu)良、穿著舒適等優(yōu)良特性，素有“纖維皇后”之美稱。一直以來，蠶的紡絲機(jī)理都是生物學(xué)家、化學(xué)家及材料學(xué)家們的研究熱點(diǎn)。迄今為止，大多科學(xué)家都認(rèn)為蠶的紡絲是液晶紡絲，但對(duì)于絲素蛋白的液晶形成機(jī)理，則存在多種不同說法，如Viney等［1－2］的鹽橋球狀棒理論、Magoshi等［3］的絲素液晶成纖理論、Kaplan等［4］的膠束理論及于同隱等［5－6］的折疊鏈理論等。對(duì)于絲素蛋白成纖過程中聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的形成，現(xiàn)有研究尚未得出一致的理論。而從蠶本身出發(fā)，研究其腺體中紡絲液的流動(dòng)狀態(tài)及聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，無疑對(duì)絲素蛋白的纖維化機(jī)理研究具有較重要的借鑒作用。

同步輻射作為X射線源，具有通量高、準(zhǔn)直性高以及波長連續(xù)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)［7］。同步輻射X射線衍射技術(shù)是研究生物大分子晶體的主要手段，已證實(shí)蠶絲具有半晶型形態(tài)結(jié)構(gòu)［8］；生物絲具有高度可延伸性主要受其微觀結(jié)構(gòu)的無序相（disordered phase）的影響，而其晶體結(jié)構(gòu)也可發(fā)生彈性形變。另外，Martel等［9－10］利用同步輻射X射線衍射技術(shù)研究了pH、剪切速率［11］對(duì)微流體管道中再生絲素蛋白水溶液構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響。本文利用同步輻射廣角X射線衍射（SR－WAXD）對(duì)五齡家蠶、解剖后的蠶腺體，以及脫膠絲進(jìn)行測(cè)試，研究干燥過程及拉伸過程中腺體內(nèi)絲素蛋白有序態(tài)結(jié)構(gòu)的演變，并探索絲素蛋白在纖維化過程中其聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的變化過程和主要影響因素。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 活蠶測(cè)試

將五齡家蠶經(jīng)丙酮麻醉后固定于金屬實(shí)驗(yàn)臺(tái)，通過改變固定蠶體的方式使其背面或側(cè)面分別置于同步輻射X射線光路中，并依次對(duì)蠶體的頭部、胸部、腹部、尾角處進(jìn)行同步輻射X射線衍射測(cè)試（圖1），采用 Mar 345成像板探測(cè)器記錄二維X射線衍射結(jié)果。因蠶腺體（圖2）以Z字型折疊在蠶體內(nèi)，蠶體尾角處主要有后部腺體（P），腹部中有部分后部腺體（P）、中部腺體后區(qū)（MP）和中區(qū)（MM），胸部中有中部腺體前區(qū)（MA）和前部腺體（A），頭部中只有部分前部腺體（A）、吐絲管和噴絲口。

圖1 同步輻射廣角X射線衍射測(cè)試家蠶示意圖（側(cè)面入光方式）Fig.1 Schematic setup of SR－WAXD experiment on silkworm （incident beam from lateral silkworm）

圖2 蠶腺體各區(qū)段示意圖Fig.2 Scheme of different divisions of silk gland

1.2 腺體及脫膠絲測(cè)試

1.2.1 有表皮濕態(tài)腺體 將五齡家蠶麻醉后置于培養(yǎng)皿中解剖，用去離子水清洗腹內(nèi)，取出兩條完整的腺體備用。腺體按其P、MP、MM、MA、A進(jìn)行切斷（圖2），將各樣品貼附于聚酰亞胺膜（商品名Kapton）上，對(duì)其進(jìn)行同步輻射X射線衍射測(cè)試。其中，后部腺體、前部腺體各測(cè)試1點(diǎn)，中部腺體各區(qū)分別測(cè)試不同兩點(diǎn)（即MPP、MPA；MMP、MMA；MAP、MAA）。另外，由于同步輻射X射線光斑較前部腺體大，因此，前部腺體測(cè)試時(shí)需將同等長度的5根前部腺體并排進(jìn)行測(cè)試。

1.2.2 去表皮濕態(tài)腺體 將蠶內(nèi)腺體取出后，用去離子水浸泡約30s，再用尖嘴鑷子將其白色表皮剝除，由于前部及后部腺體的表皮不易去除，本實(shí)驗(yàn)僅將中部腺體切為MP、MM、MA 3段進(jìn)行測(cè)試，方法同上。

1.2.3 腺體的干燥 取去表皮濕態(tài)腺體MM、MA兩段分別進(jìn)行干燥，每隔5min左右測(cè)試1次，且用稱重法對(duì)其稱量，若5min內(nèi)其質(zhì)量波動(dòng)范圍在0.1%之內(nèi)，即認(rèn)為腺體已完全干燥。總測(cè)試時(shí)間約為1～2h，測(cè)試方法同上。

1.2.4 腺體及脫膠絲的拉伸 將去表皮濕態(tài)腺體MM固定于自制拉伸儀，分別以拉伸速度17.4及29.0μm／s進(jìn)行拉伸，并對(duì)其進(jìn)行同步輻射X射線衍射原位測(cè)試。為了對(duì)比結(jié)果，將成束脫膠絲［12］固定于相同光路進(jìn)行X射線衍射測(cè)試。

1.3 同步輻射光束線參數(shù)

儲(chǔ)存環(huán)能量，800MeV；流強(qiáng)，200mA；光斑尺寸，2mm×1mm；X射線波長，0.154nm；束線阻攔器尺寸，1cm×1cm；探測(cè)器直徑，345mm；成像板像素，150μm。樣品到探測(cè)器距離與放樣方式有關(guān)，介于155～176mm。實(shí)驗(yàn)過程中，光源光斑位置未隨時(shí)間變動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)在國家同步輻射實(shí)驗(yàn)室（合肥）X射線衍射和散射試驗(yàn)站完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯薄片為標(biāo)樣，利用軟件FIT2D對(duì)其衍射環(huán)進(jìn)行圓心定位，并校準(zhǔn)樣品到探測(cè)器距離。為避免成像板原有圖樣的影響，對(duì)樣品二維衍射圖譜的左下角部分做相同角度區(qū)域的90°扇形積分，得到其一維衍射圖譜。利用Origin 8扣除對(duì)應(yīng)背景的衍射數(shù)據(jù)，得到實(shí)際樣品的一維衍射圖譜。上述標(biāo)定的圓心和樣品到探測(cè)器的距離可用于相同放樣方式下的所有測(cè)試樣品。由于放樣方式不同，各樣品所扣除的背景衍射數(shù)據(jù)以及樣品到探測(cè)器距離有所不同。對(duì)于活蠶、拉伸的腺體和脫膠絲，扣除的背景是空氣的衍射數(shù)據(jù)；對(duì)于未拉伸的腺體，所扣除的背景是Kapton膜和空氣的衍射數(shù)據(jù)。對(duì)于活蠶和未拉伸的腺體（固定于出光口），校正后的樣品到探測(cè)器距離為155mm；對(duì)于拉伸的腺體和脫膠絲（固定于拉伸儀），校正后的樣品到探測(cè)器距離為176mm。當(dāng)樣品固定于拉伸儀時(shí)，需移動(dòng)探測(cè)器，使拉伸儀置于出光口和探測(cè)器之間。

2 結(jié)果與討論

2.1 活蠶蠶體不同部位及測(cè)試方式對(duì)其WAXD結(jié)果的影響

家蠶絲素蛋白的結(jié)晶結(jié)構(gòu)通常分為絲素Ⅰ（silkⅠ）和絲素Ⅱ（silkⅡ）兩種結(jié)構(gòu)［13］。silkⅡ是以氫鍵連接的反平行β－片層（β－sheet）結(jié)構(gòu)，而silkⅠ由于其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)變成為結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的silkⅡ結(jié)構(gòu)，使得對(duì)它的結(jié)構(gòu)研究較困難，并存在一些爭(zhēng)議。例如：在Lotz等［14］提出的曲軸模型中，丙氨酸殘基和谷氨酸殘基分別以 β－片層和 α－螺旋構(gòu)象存在；在 Fossey等［15］提出的模型中，左旋的片層結(jié)構(gòu) （lefthanded sheet－like conformation）和右旋的片層結(jié)構(gòu)（right－h(huán)anded sheet－like conformation）共存，且左右扭曲程度相同；Asakura等［16－17］認(rèn)為silkⅠ是一種重復(fù)的Ⅱ類β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

使用0.154nm的X射線光束，文獻(xiàn)［18－19］中silkⅡ（β－片層）結(jié)構(gòu)的主要結(jié)晶衍射峰在2θ＝20°左右。其中，2θ＝19.7°的衍射峰（［200］晶面，晶面間距為0.45nm）與分子鏈間的排列相關(guān)（圖3中方向a），而2θ＝20.6°的衍射峰（［020］晶面，晶面間距為0.43nm）與β－片層之間的排列相關(guān)（圖3中方向b）。由于這兩個(gè)衍射峰很接近，常重疊為1個(gè)衍射峰。另外，silkⅡ還在2θ＝8.7°、9.9°（［010］晶面）、23.3°（［002］晶面）、24.5°（［201］晶面）、27.3°（［012］或［220］晶面）、29.7°（［030］晶面）、31.8°（［022］或［130］晶面）、39.0°（［003］晶面）和39.9°（［040］晶面）處有結(jié)晶衍射峰，對(duì)應(yīng)的晶面間距分別為1.01、0.895、0.38、0.36、0.326、0.301、0.281、0.231 和0.226nm。silkⅠ 的 主 要 結(jié) 晶 衍 射 峰 在2θ＝12.3°左右（晶面間距為0.72nm），2θ＝15.8°、18.9°為α－螺旋的衍射峰（晶面間距分別為 0.47nm 和 0.56nm）［13］。 另 外，2θ＝11.5°～12.5°范圍內(nèi)的平緩衍射峰通常被認(rèn)為與絲素蛋白無定型結(jié)構(gòu)相關(guān)［18］。

圖3 silkⅡ（β－片層）結(jié)晶結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Scheme of silkⅡ （β－sheet）crystal structure

圖4和5分別為蠶體各部位的二維和一維X射線衍射圖譜。從圖4可看出，與蠶體胸部、腹部及尾角處相比，蠶頭部的X射線衍射圖譜明顯不同。從圖5可進(jìn)一步看出，無論采用側(cè)面入光還是背面入光的方式測(cè)試，蠶體胸部、腹部和尾角處的X射線衍射曲線均較平滑，而其頭部的衍射曲線的衍射峰較明顯，強(qiáng)度也高于其他部位的曲線。這可能是由于X射線穿透蠶體胸部、腹部及尾角處時(shí)，被其表皮或體內(nèi)器官部分吸收，因此無法得到明顯的衍射信息。蠶頭部的衍射圖譜中均有明顯衍射峰，但不同測(cè)試方式所得到的峰位和強(qiáng)度有所不同。當(dāng)采用側(cè)面入光方式測(cè)試時(shí)，圖5a中在8.8°、19.8°及27.1°處出現(xiàn)了衍射峰，結(jié)合文獻(xiàn)［18－19］可知，這些峰分別與silkⅡ結(jié)晶結(jié)構(gòu)中晶面間距為1.01、0.895及0.326nm的晶面的衍射有關(guān)。當(dāng)采用背面入光方式測(cè)試時(shí)，圖5b中分別在12.3°、18.9°及27.3°附近有3個(gè)明顯的衍射峰。其中，12.3°的衍射峰是silkⅠ的衍射峰（晶面間距為0.72nm）；27.3°的 衍 射 峰 是silkⅡ 的［012］或［220］晶面的衍射峰；18.9°處的衍射峰是晶面間距為0.56nm的α－螺旋結(jié)構(gòu)的衍射峰。對(duì)其的解釋可能為絲素蛋白在蠶頭部吐絲口處形成纖維的過程中，絲素蛋白大部分已轉(zhuǎn)變?yōu)閟ilkⅡ晶體結(jié)構(gòu)，但仍存在部分未轉(zhuǎn)變完成的α－螺旋結(jié)構(gòu)。比較圖5a及b可發(fā)現(xiàn)，同樣是蠶的頭部，入光方式的不同造成衍射峰的形狀區(qū)別很大。該現(xiàn)象可能是由蠶頭部軀殼的衍射或?qū)射線的吸收所引起的。由于無法對(duì)蠶頭部軀殼單獨(dú)制樣實(shí)驗(yàn)，尚不能確定具體影響大小。由上述分析可知，衍射曲線上標(biāo)示的具體峰位與silkⅡ或silkⅠ結(jié)構(gòu)的衍射峰位十分接近，因此可認(rèn)為這些衍射峰與絲素蛋白晶體結(jié)構(gòu)相關(guān)的可能性更大。另外，圖4中蠶頭部的二維衍射圖均為同心圓環(huán)狀，說明此時(shí)在吐絲口中的初生纖維中，結(jié)晶區(qū)沒有明顯取向，這是由于纖維尚未經(jīng)過蠶頭部的扭動(dòng)拉伸。

圖4 活蠶的WAXD二維圖譜Fig.4 2－D WAXD patterns of silkworm

2.2 絲素蛋白在濕態(tài)腺體不同部位中的有序態(tài)結(jié)構(gòu)

圖6為濕態(tài)腺體各區(qū)段的WAXD一維圖譜，其中，圖6a中的腺體有表皮，圖6b中的腺體被剝除表皮。對(duì)于有表皮的濕態(tài)腺體，P、MPP只在11.5°處出現(xiàn)1組平緩的衍射峰，通常被認(rèn)為此與絲素蛋白無定型結(jié)構(gòu)相關(guān)；MPA、MMP、MMA、MAP出現(xiàn)兩組衍射峰，除在11.5°處出現(xiàn)與之前類似的衍射峰外，還分別在27.0°、27.3°及26.9°處出現(xiàn)1組衍射峰。這組衍射峰的峰位接近或等于27.3°，可能與silkⅡ結(jié)晶結(jié)構(gòu)中晶面間距為0.326nm的［012］或［220］晶面的衍射有關(guān)。而且，腺體在接近中部腺體前區(qū)的MAP的過程中，該峰位有逐漸接近27.3°的趨勢(shì)。這說明腺體中的silkⅡ結(jié)構(gòu)有可能在向前部絲腺流動(dòng)的過程中逐漸形成。另外，如圖7所示，水的衍射峰的峰位大約在28.0°附近，因此該組衍射峰還可能與腺體中水的含量有關(guān)。腺體中較高的水含量，可能導(dǎo)致27°附近衍射峰的峰強(qiáng)變大。對(duì)于去表皮的濕態(tài)腺體（圖6b），結(jié)果與有表皮的濕態(tài)腺體基本相似。從圖6a中還可看出，與帶皮腺體的其他區(qū)段相比，P、MPP、MAA、A區(qū)段在11.5°附近的無定形結(jié)構(gòu)的衍射峰較明顯，而在27.3°附近出現(xiàn)的衍射峰強(qiáng)度較弱或不存在，這可能與該部分腺體的直徑較小、表皮所占比例較大、絲素水溶液所占比例較少有關(guān)。其中，A區(qū)段中絲素溶液的濃度最高，腺體直徑最小，卻在27.3°附近出現(xiàn)的衍射峰強(qiáng)度較P、MPP、MAA稍強(qiáng)，因此可能與P、MPP、MAA中silkⅡ結(jié)構(gòu)尚未明顯形成有關(guān)。

圖5 活蠶不同部位的WAXD一維圖譜Fig.5 1－D WAXD patterns of different parts of silkworm

圖6 濕態(tài)腺體各區(qū)段的WAXD一維圖譜Fig.6 1－D WAXD of different divisions of wet silk gland

2.3 干燥過程對(duì)腺體中絲素蛋白有序態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

為了研究水分流失對(duì)絲素蛋白晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的影響，對(duì)不同干燥時(shí)間的去表皮濕態(tài)腺體進(jìn)行了同步輻射WAXD測(cè)試。圖7為MA、MM干燥過程的測(cè)試結(jié)果，圖中可明顯觀察到干燥過程中衍射峰位置發(fā)生了明顯變化。對(duì)于MA（圖7a），從初始干燥階段的衍射峰可看出其含有無定形結(jié)構(gòu)，與前述濕態(tài)腺體的測(cè)試結(jié)果相符。隨著水分減少，位于28.0°處的水的衍射峰強(qiáng)度逐漸減弱直至消失，其2θ值也隨之減小。干燥完成后，位于11.5°處的平緩衍射峰消失，而在11.9°處出現(xiàn)尖峰，其數(shù)值與晶面間距為0.72nm的silkⅠ的衍射峰相近（12.3°）。另外，在19.7°處出現(xiàn)了1組與silkⅡ結(jié)構(gòu)相關(guān)的晶面間距為0.45nm的［200］晶面的衍射峰，同時(shí)在27.8°處出現(xiàn)1組肩峰，接近于晶面間距為0.326nm 的［012］或［220］晶面的衍射峰（27.3°）。而 MM（圖7b）與 MA干燥過程的變化基本相似，但干燥完成時(shí)間遠(yuǎn)長于MA。由于MA比MM更接近于吐絲口，因此MA處紡絲液的組成也更接近于吐絲口處紡絲液的組成（如pH降低且更接近絲素蛋白的等電點(diǎn)）。而紡絲液從吐絲口處噴出時(shí)可迅速固化，因此MA處紡絲液的固化速度也較快。

圖7 水及中部腺體在不同干燥時(shí)間的WAXD一維圖譜Fig.7 1－D WAXD of water and the middle division of silk gland at different drying time

從上述結(jié)果可看出，濕態(tài)腺體在干燥過程中，絲素蛋白中水分流失而固化，同時(shí)絲蛋白構(gòu)象發(fā)生變化。水的衍射峰逐漸減弱乃至消失，而與silkⅠ、silkⅡ晶體結(jié)構(gòu)有關(guān)的衍射峰逐漸增多。絲素蛋白構(gòu)象從無定形結(jié)構(gòu)逐漸失水轉(zhuǎn)變成交替堆積的α－螺旋和／或β－平行折疊構(gòu)象趨于由β－反平行折疊形成完整的silkⅡ?qū)訝罹w結(jié)構(gòu)。另外，對(duì)中部腺體干燥前后的二維衍射圖譜（圖8）進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，干燥后的圖譜為同心圓環(huán)，這說明水分的流失可誘導(dǎo)絲素蛋白結(jié)晶，但結(jié)晶區(qū)并未發(fā)生明顯取向，蠶絲中的晶區(qū)取向可能是在蠶吐絲后經(jīng)過頭部的扭動(dòng)拉伸而誘導(dǎo)形成的。

圖8 中部腺體在不同干燥時(shí)間的WAXD二維圖譜Fig.8 2－D WAXD of the middle division of silk gland at different drying time

2.4 中部絲腺在拉伸過程中有序態(tài)結(jié)構(gòu)的演化

為了研究拉伸對(duì)腺體有序態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)腺體進(jìn)行勻速拉伸并結(jié)合SR－WAXD進(jìn)行測(cè)試（圖9）。從圖9a中可發(fā)現(xiàn)，拉伸速度為17.4μm／s時(shí)，隨著拉伸倍率（拉伸位移與腺體原長的比值）的增加，水的衍射峰（28.1°）強(qiáng)度逐漸減少，乃至消失；在38.6°處出現(xiàn)的弱峰，其數(shù)值與晶面間距為0.231nm的［003］晶面的衍射峰相近（39.0°），衍射強(qiáng)度發(fā)生小幅增強(qiáng)。當(dāng)拉伸倍率達(dá)0.7時(shí)，在22.6°附近出現(xiàn)1組與silkⅡ結(jié)構(gòu)相關(guān)的［002］晶面的肩峰，其強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)。拉伸倍率達(dá)1.0時(shí)，在9.2°、24.9°處附近出現(xiàn)兩組衍射峰，其中2θ＝9.2°的衍射峰有可能與silkⅡ結(jié)晶結(jié)構(gòu)的［010］晶面相 關(guān)，2 4.9°處較尖的衍射峰與晶面間距為0.36nm 的［201］晶面的衍射峰相近（24.5°）。而拉伸倍率達(dá)1.8時(shí)，出現(xiàn)在20.6°處的衍射峰是silkⅡ的［020］晶面的衍射峰。從圖9b可發(fā)現(xiàn)，拉伸速度為29.0μm／s時(shí)，各衍射曲線與圖9a有相似的變化趨勢(shì)。不同之處在于：當(dāng)拉伸倍率達(dá)1.5時(shí)，在21.5°、23.8°及41.9°處出現(xiàn)的峰位均接近脫膠絲的衍射峰；出現(xiàn)在27.2°處的衍射峰，與silkⅡ晶體結(jié)構(gòu)的［012］或［220］晶面的衍射峰有關(guān)（27.3°）。對(duì)于37°左右的尖峰，與文獻(xiàn)中silkⅠ和silkⅡ結(jié)構(gòu)的衍射峰不同，尚有待進(jìn)一步研究。從上述結(jié)果可看出，以較慢速度拉伸腺體的過程中，腺體逐漸脫水，與silkⅡ結(jié)構(gòu)相關(guān)的晶面衍射峰逐漸增多，且強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；當(dāng)拉伸速度增大時(shí)，這種趨勢(shì)更加明顯，且衍射峰的峰位愈接近于脫膠絲的峰位。這說明拉伸是絲素蛋白成纖的主要誘導(dǎo)因素，并使絲素蛋白向silkⅡ結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。另外，將中部腺體不同拉伸倍率下的二維衍射圖譜與脫膠絲（圖10）進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，脫膠絲的衍射圖譜中可觀察到明顯的衍射光斑，而1.8倍拉伸后的中部腺體并未發(fā)現(xiàn)明顯的光斑，說明中部腺體被拉伸1.8倍時(shí)，結(jié)晶區(qū)并不會(huì)因拉伸而有明顯取向。而蠶在紡絲過程中，遠(yuǎn)大于1.8的拉伸倍率導(dǎo)致脫膠絲有明顯的取向結(jié)構(gòu)。

圖9 脫膠絲（DS）及中部腺體中區(qū)（MM）在不同拉伸速度及拉伸倍率下的WAXD一維圖譜Fig.9 1－D WAXD of degummed silk and the middle division of silk gland at different drawing rates and drawing ratios

圖10 脫膠絲及中部腺體中區(qū)（MM）在不同拉伸倍率下的WAXD二維圖譜Fig.10 2－D WAXD of degummed silk and the middle division of silk gland at different drawing ratios

3 結(jié)論

絲素蛋白在五齡熟蠶頭部吐絲口處形成與silkⅠ、silkⅡ晶體相關(guān)的結(jié)構(gòu)；絲腺內(nèi)水分流失誘導(dǎo)絲素蛋白形成有序態(tài)結(jié)構(gòu)，濕態(tài)腺體在干燥過程中，其構(gòu)象轉(zhuǎn)變成β－反平行折疊并趨于形成完整的silkⅡ?qū)訝罹w結(jié)構(gòu)；拉伸作用為絲素蛋白成纖化的主要影響因素，可誘導(dǎo)絲素蛋白形成silkⅡ晶體結(jié)構(gòu)。

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