中風1號湯劑對急性腦出血大鼠NSE蛋白水平影響及改善神經(jīng)功能缺損的實驗研究

梁群，朱永志，楊瀅，于倩，郝娟，劉茜

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血，屬于中醫(yī)學(xué)中出血性中風范疇，是嚴重危及人類生命健康的常見病、多發(fā)病，其患病率、致殘率及病死率均較高，為患者家庭帶來經(jīng)濟上和精神上雙重的負擔［1－2］。近年來，腦出血具有年輕化及逐年上升趨勢。西醫(yī)對腦出血的內(nèi)科治療主要集中在對癥支持療法上，如防治腦水腫、降低顱內(nèi)壓等等，但長期預(yù)后效果并不理想。近年來，中藥干預(yù)治療腦出血的研究取得了可喜的成績［3］，本研究通過觀察中風1號湯劑對大鼠急性腦出血神經(jīng)缺損功能及腦水腫癥狀的改善，及中藥干預(yù)前后血清NSE濃度的變化，初步探討中醫(yī)藥治療急性腦出血的療效，從而為今后的中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科保守治療提供一定的參考。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，雄性，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提拱，按清潔級標準飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器及試劑

大鼠腦立體定位儀(型號:TSE，德國進口);電熱鼓風干燥箱(型號:CS101－2E，中外合資重慶四達實驗儀器有限公司);電子天平，低速臺式離心機(型號:TDL－80－2B，上海安亭科學(xué)儀器廠);10%水合氯醛溶液(天津市福晨化學(xué)試劑廠);大鼠神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)ELISA檢測試劑盒(美國R＆D Systems);30%過氧化氫;聚維酮碘溶液;100ul微量注射器。

1.3 藥物

中風1號湯劑主要由黃芪，當歸，川芎等中藥配伍而成(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬一院提供的院內(nèi)制劑);20%甘露醇(石家莊四藥有限公司，規(guī)格:250ml/瓶，國藥準字H1302303);肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格:12 500U/2ml，2ml×10支，批號0705105);注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，規(guī)格:160萬u/瓶，批號D0804310)。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組

將50只雄性Wistar大鼠隨機分為5組，每組10只，即中藥組(中風1號組)、西藥組(甘露醇組)、中西藥聯(lián)合組(中風1號聯(lián)合甘露醇組)、假手術(shù)組、空白組。假手術(shù)組為對照組。分別觀察各組動物用藥前后神經(jīng)功能缺損情況，以及第5天血清NSE水平的變化，并測定腦組織含水量。

2.2 造模

制備大鼠急性腦出血模型［4］。

1 )麻醉并固定:大鼠稱取質(zhì)量，用10%水合氯醛，以0.4uL/1g腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定向儀上;2)定位:備皮，局部消毒。正中縱行切口，30%雙氧水腐蝕骨膜暴露前囟及進針點。靶點定位于前囟為0點、中線左側(cè)旁開3mm、前囟后0.4mm，進針點處用牙科鉆鉆一個直徑1mm圓孔至硬膜表面，勿鉆通硬腦膜;3)取血及注血:剪尾取血，用微量進樣器抽取血量67μL(因大鼠腦出血 1μL相當于人腦出血0.75mL，故上述出血量分別相當于人腦出血50mL)。血液靜置5min使之半凝固。針頭通過鉆孔垂直緩慢進入腦內(nèi)，并將凝固血快速注入靶點內(nèi)(注射速度20μL/min)，并留針30min，拔針。局部涂用注射用青霉素鈉，并縫合刀口。同時腹腔注射青霉素鈉20萬U，連續(xù)應(yīng)用5天，防止術(shù)后感染而影響實驗結(jié)果。

假手術(shù)組:造模方法同上，但是不向腦內(nèi)注射血。

2.3 給藥

大鼠的用藥量按成人劑量與人體質(zhì)量折算系數(shù)比公式計算［5］。

中藥組:中風一號湯劑，1.5ml灌胃，2次/天。生理鹽水1g/kg，2次/天股靜脈注射。術(shù)后持續(xù)給藥5天;西藥組:生理鹽水，1.5ml灌胃，2次/天。甘露醇1g/kg，2次/天股靜脈注射。術(shù)后持續(xù)給藥5天;中西藥結(jié)合組:中風一號湯劑，1.5ml灌胃，2次/天。甘露醇1g/kg，2次/天股靜脈注射。術(shù)后持續(xù)給藥5天;假手術(shù)組:生理鹽水，1.5ml灌胃，2次/天。生理鹽水1g/kg，2次/天股靜脈注射。術(shù)后持續(xù)給藥5天;空白組:生理鹽水，1.5ml灌胃，2次/天。生理鹽水1g/kg，2次/天股靜脈注射。術(shù)后持續(xù)給藥5天。

2.4 造模成功評分

在所有動物麻醉完全清醒后(約術(shù)后3h)，參照Zea－Longa方法［6］進行各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分(Neurological deficit score，NDS)，分為5 分:

0 分:正?；顒樱瑹o神經(jīng)功能缺損;1分:將大鼠尾巴提起，癱瘓側(cè)前肢不能充分伸展;2分:大鼠有向癱瘓側(cè)偏轉(zhuǎn)的行為;3分:向癱瘓側(cè)傾倒;4分:不能行走，有意識障礙。

2.5 樣品采集及血清NSE檢測

10%水合氯醛麻醉，剖腹，腹主動脈取血4ml，并離心，參照說明書，采用酶聯(lián)免疫分析法測定血清NSE水平。

2.6 腦組織含水量測定

10%水合氯醛麻醉，斷頭處死，開顱取腦，生理鹽水沖洗后用濾紙吸盡腦表面血漬和水分，取出血灶周圍約3mm腦組織置于電子天平上稱濕重并記錄，再將標本置于100℃恒溫箱烘烤1天后再稱干重。并按照Elliot公式計算:腦組織含水量(%)=(濕重－干重)/濕重×100%。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標準差(±s)表示，組間數(shù)據(jù)比較用方差分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能缺損評分

從表1可以看出，各組與假手術(shù)組比較，均有顯著性差異(P＜0.01);前四組組間內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明造模成功。

從表2可以看出，術(shù)后第5天，各組與假手術(shù)組比較，均有顯著性差異(P＜0.01);各組與空白組比較，具有顯著性差異(P＜0.01)，空白組NDS明顯高于其他組;中藥組、西藥組與中西醫(yī)結(jié)合組比較，具有顯著性差異(P＜0.05);單純中藥組與單純西藥組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 術(shù)后0天大鼠NDS評分(±s)

表1 術(shù)后0天大鼠NDS評分(±s)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01。

NDS中藥組 9 2.43 ±1.023組別n＊＊西藥組 8 2.39 ±0.990＊＊中西醫(yī)結(jié)合組 9 2.42 ±0.963＊＊空白組 9 2.40 ±0.680＊＊假手術(shù)組10 0.00 ±0.00

表2 術(shù)后5天大鼠NDS評分(±s)

表2 術(shù)后5天大鼠NDS評分(±s)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△△P＜0.01;與中西醫(yī)結(jié)合組比較，#P＜0.05。

NDS中藥組 9 2.10 ±1.023＊＊△△#組別n 10 0.00 ±0.00西藥組 8 2.08 ±0.982＊＊△△#中西醫(yī)結(jié)合組 9 1.79 ±1.245＊＊△△空白組 9 3.27 ±0.530＊＊假手術(shù)組

3.2 血清NSE水平測定

從表3可以看出，術(shù)后第5天，各組與假手術(shù)組比較，均有顯著性差異(P＜0.01);各組與空白組比較，具有顯著性差異(P＜0.01)，空白組NSE水平明顯高于各組;中藥組、西藥組與中西醫(yī)結(jié)合組比較，具有顯著性差異(P＜0.01);單純中藥組與單純西藥組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。說明中藥組與西藥組均可降低NSE含量，但兩者之間無差異，而中西醫(yī)結(jié)合組NSE含量顯著降低，說明中西醫(yī)結(jié)合組能有效減輕出血性中風大鼠急性期神經(jīng)元損傷，并有改善預(yù)后作用。

表3 術(shù)后5天大鼠血清NSE水平(±s)

表3 術(shù)后5天大鼠血清NSE水平(±s)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△△P＜0.01;與中西醫(yī)結(jié)合組比較，##P＜0.01。

NSE中藥組 9 19.07 ±2.62＊＊△△##組別n 10 6.34 ±1.31西藥組 8 18.29 ±2.59＊＊△△##中西醫(yī)結(jié)合組 9 12.82 ±1.72＊＊△△空白組 9 24.13 ±2.16＊＊假手術(shù)組

3.3 腦組織含水量測定

從表4可以看出，術(shù)后第5天，各組腦組織含水量與假手術(shù)組比較，均有顯著性差異(P＜0.05);各組與空白組比較，也具有顯著性差異(P＜0.05)，尤其是中西醫(yī)結(jié)合組(P＜0.01)，說明空白組腦組織含水量明顯高于各組;中藥組、西藥組與中西醫(yī)結(jié)合組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，說明中西藥結(jié)合組能明顯降低腦組織含水量;單純中藥組與單純西藥組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表4 術(shù)后5天大鼠腦組織含水量(±s)

表4 術(shù)后5天大鼠腦組織含水量(±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與中西醫(yī)結(jié)合組比較，#P＜0.05。

組別 n 腦含水量(﹪)中藥組 9 79.42 ±0.89＊△#10 77.24 ±0.42西藥組 8 79.35 ±0.77＊△#中西醫(yī)結(jié)合組 9 78.76 ±1.72＊△△空白組 9 83.35 ±0.54*假手術(shù)組

4 討論

烯醇化酶是參與糖酵解的關(guān)鍵酶，其普遍存在于生物體內(nèi)的糖酵解代謝中，尤其是γγ型同功酶，其特異地存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞內(nèi)，故又稱為神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)［7］，正常條件下，NSE特異性地存在于神經(jīng)元細胞漿內(nèi)，當缺氧、缺血或中毒的情況下，神經(jīng)元細胞膜的完整性遭到破壞，使NSE從細胞內(nèi)漏到細胞外，進入細胞間隙，并進入腦脊液，再透過血腦屏障進入血管內(nèi)，從而進入血液循環(huán)［8］。因此，有的學(xué)者認為，腦脊液和血清NSE水平可用來判斷急性期腦出血病情程度及預(yù)后［9］。

腦水腫是腦出血的重要并發(fā)癥，也是臨床急性腦血管疾病病情加重和死亡的主要原因。腦出血引起顱腦損傷的機制中，腦組織水腫引起顱內(nèi)壓異常升高是首要因素，因此西醫(yī)內(nèi)科保守治療急性腦出血，脫水降顱內(nèi)壓是最重要原則。所以，腦組織含水量的測定有對于判斷藥物治療效果以及患者病情發(fā)展情況非常有意義。

中風1號是由黃芪、當歸、川芎等中藥配伍而成，具有益氣活血，祛瘀通絡(luò)，扶正之功效，是朱永志教授治療急性腦出血臨床經(jīng)驗的總結(jié)，是緩解急性期腦出血癥狀并改善患者預(yù)后的有效中藥。

本研究顯示，中風1號湯劑組，西藥組及中西醫(yī)結(jié)合組均對大鼠腦出血性損傷引起的神經(jīng)功能缺損及腦水腫有明顯改善作用，且能夠明顯降低血清NSE水平，尤其是中西醫(yī)結(jié)合組，效果非常顯著(P＜0.01)，而單純中風1號湯劑組與單純西藥組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。推測其機制可能與中藥改善腦出血后腦血流動力學(xué)，維護血腦屏障正常的通透性，穩(wěn)定神經(jīng)元細胞膜，減少組織滲出，減輕腦水腫及NSE的釋放，從而具有保護神經(jīng)組織，改善患者預(yù)后的作用。

［1］ 朱慧淵.運用“治未病”理論防治腦中風探析［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38(6):6 －8.

［2］ 鈔建峰，賈慧，孫風平.試述以“虛”為核心的中風病機觀［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(2):67 －68.

［3］ 張友堂，陳磊.續(xù)命湯治中風新解［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38(5):103.

［4］呂田明，陸兵勛.大鼠尾狀核注射凝固自體動脈血腦出血模型［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2006，23(1):88－90.

［5］ 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出社，1993:33－35.

［6］ Zea longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversibal middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84－91.

［7］ 關(guān)景霞，余紹祖，曾慶杏.神經(jīng)元特異性烯醇化酶和S－100蛋白在腦血管疾病中的臨床意義［J］.國外醫(yī)學(xué)·腦血管疾病分冊，2000，8(4):242 －244.

［8］ Barone FC，Clark RK，Price WJ，et al.Neuron － specific enolase in creases in cerebral and systenic circulation following focal insche mia［J］.Brain Res，1993，623:77 －82.

［9］ Schaarsschmidt H，Prange HW，Reiber H.Neuron specific enclose concentrations in blood as a prognostic parameter in cerebrovas cular diseases［J］.Stroke，1994，25(6):558 －565.