銀消顆粒對小鼠細胞因子影響的實驗研究

劉擁軍，王璐，張磊，張健

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥銀消顆粒由大黃，苦參，黃芩，連翹，玄參等組成，在臨床用于血熱濕毒內(nèi)蘊型銀屑病的治療。本課題通過研究其對銀屑病小鼠模型TNF－α、IL－18和IL－10的影響，以免疫學(xué)為切入點，探討中藥銀消顆粒防治銀屑病的作用機制。

1實驗材料

1.1 受試藥物

銀消顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司，批號0806119);甲氨喋呤(上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥總廠，國藥準(zhǔn)字H31020644);生理鹽水(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H23020612)。

1.2 實驗動物

昆明種小白鼠，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.3 主要試劑

(TNF－α)腫瘤壞死因子－α ELISA試劑盒、白介素－10(IL－10)ELISA檢測試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司);白介素－18(IL－18)ELISA檢測試劑盒(美國R＆D Systems進口分裝)。

1.4 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(德國 Heraevs);酶標(biāo)儀(BIORAD680中國香港);超凈工作臺(SM－CJ－IT蘇州凈化設(shè)備制造公司);紫外分光光度計(上海分析儀器廠)。

2實驗方法［1］

2.1 動物分組

取昆明種小白鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，隨機分為5組。生理鹽水陰性對照組(NS)，甲氨喋呤陽性對照組(MTX)，銀消顆粒分3個劑量組(低銀、中銀、高銀)，為治療組。

2.2 動物的給藥劑量

生理鹽水陰性對照組為0.18g/kg(0.2ml/10g)，甲氨喋呤陽性對照組為0.001g/kg(0.2ml/10g)，銀消顆粒各濃度組為 0.65g/kg、1.3g/kg、2.6g/kg(0.2ml/10g)。

2.3 動物造模

把各組動物分別稱體質(zhì)量，按給藥劑量，NS組、MTX組和中藥各組用灌飼器灌胃給藥，均每天1次，連續(xù)用藥14天。在用藥期間，每間隔2天稱量體質(zhì)量1次，以調(diào)整給藥量。

2.4 實驗藥物制備

用重蒸水1∶20稀釋;底物工作液配制:使用前將OPD片放入底物稀釋液中溶解，每片加液5ml;標(biāo)準(zhǔn)品液配制:使用前每管中加入蒸餾水200μl溶解后即可。

2.5 收集上清

脫頸處死小鼠，酒精消毒。腹腔注入含5%小牛血清的Hank`s(5%NBS－HBSS)，輕揉腹部吸出腹腔液體，1 500r/min離心8min，棄上清。將腹腔細胞用含10%小牛血清1640液(10%NBS－1640)配成2×109個/L懸液，加入到24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。每孔用5%NBS－HBSS洗3次，貼壁細胞為巨噬細胞單層。每孔加入終濃度為10ug/ml的LPS 1ml，以激活巨噬細胞，培養(yǎng)4h后，收集上清，置－20℃冰箱保存待測TNF－α。另加入10%NBS－1640 1ml，繼續(xù)培養(yǎng)至 24h，3 000r/min 離心10min，收集上清，置－20℃冰箱保存待測IL－18。

在超凈工作臺于無菌條件下，取各組小鼠脾臟，用Hank`s液常規(guī)制備脾細胞懸液，用完全RPMI 1640培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)到1×1010個/L。鋪板加樣，于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入脾細胞懸液100ul，再加入100ul含5mg/L(終濃度)ConA的培養(yǎng)液，置37℃5%CO2孵箱孵育，培養(yǎng)48h收集上清。采集的上清應(yīng)盡早檢測，2～8℃保存 1天;需更長時間須冷凍(－20℃)保存，避免反復(fù)凍融。

2.6 指標(biāo)測定與計算

在酶標(biāo)儀492nm、450nm處測吸光值，所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。使用SPSS 12統(tǒng)計學(xué)分析軟件，單因素方差分析，t檢驗。

3結(jié)果見表1～表3。

表1 銀消顆粒對小鼠TNF－α的影響

表2 銀消顆粒對小鼠IL－18的影響

表3 銀消顆粒對小鼠IL－10的影響

4討論

4.1 銀消顆粒對TNF－α的影響

腫瘤壞死因子是銀屑病免疫學(xué)發(fā)病機制中重要的細胞因子，在銀屑病皮損處炎細胞的浸潤方面起重要作用。銀屑病皮損表皮的T細胞可產(chǎn)生TNF－α，皮損處角質(zhì)形成細胞及內(nèi)皮細胞存在TNF－α強表達，并可能在誘導(dǎo)P－選擇素，E－選擇素等黏附分子的表達方面具有重要作用，銀屑病患者表皮過度增殖與TNF引起的角蛋白K6，K16，K17等基因異常表達有關(guān)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，銀消顆粒各劑量組均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF－α，中、高劑量組與MTX組比較無顯著差異，低劑量組與MTX組比較有顯著差異，而且隨著濃度的升高抑制作用逐漸增強。說明銀消顆粒具有抑制巨噬細胞產(chǎn)生TNF－α的功能。

4.2 銀消顆粒對IL－18的影響

IL－18是一種炎性細胞因子，其結(jié)構(gòu)與IL－1家族類似，原名IFN－γ誘導(dǎo)因子，是強有力的INF－γ誘導(dǎo)劑，直接作用于NK細胞，刺激INF－γ的合成。激活淋巴細胞和巨噬細胞，直接促進TNF－α的產(chǎn)生，IL－18在一系列免疫性疾病中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。在炎癥反映中起著雙向調(diào)節(jié)的作用，可調(diào)節(jié)Thl和Th2型免疫反應(yīng)。IL－18活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生IFN－γ，并與IL－12協(xié)同刺激Thl型免疫應(yīng)答，促進Thl型細胞增殖和IL－2分泌，抑制活化的T細胞產(chǎn)生IL－10。有學(xué)者研究證明［2］銀屑病患者外周血血清中的IL－18水平與PASI評分呈正相關(guān)。在研究中，發(fā)現(xiàn)銀消顆粒各劑量組可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IL－18，并與MTX組比較均無顯著差異，而且藥物濃度的升高與抑制作用呈正相關(guān)。說明銀消顆粒具有抑制巨噬細胞產(chǎn)生IL－18的功能。

4.3 銀消顆粒對IL－10的影響

IL－10不僅抑制Th1細胞合成IFN－γ，還可抑制前炎癥細胞因子的產(chǎn)生，影響單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞的抗原遞呈能力，促進Th2型細胞因子模式的發(fā)展，調(diào)節(jié)Th1/TH2的平衡。臨床上治療銀屑病的藥物如糖皮質(zhì)激素、卡泊三醇、維生素D3、蒽林等，可以使 IL －10 的表達顯著增加［3］。Seifert等［4］認為，IL－10不直接對角質(zhì)形成細胞發(fā)揮作用，而是通過對循環(huán)免疫細胞的調(diào)節(jié)效應(yīng)達到抗銀屑病的作用。實驗研究證明，銀消顆粒各劑量組可顯著增強ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細胞產(chǎn)生IL－10，高、中劑量組與MTX組比較有非常顯著差異，而且藥物濃度的升高與促進作用呈正相關(guān)。說明銀消顆粒在治療銀屑病過程中促進了IL－10的產(chǎn)生。

銀屑病不僅有局部皮膚的病理變化特征，它的發(fā)病還與體內(nèi)免疫功能的失調(diào)有關(guān)［5］。由其分泌而形成的細胞因子在病理信息傳遞網(wǎng)絡(luò)中有著重要的作用，是誘導(dǎo)銀屑病表皮動力學(xué)紊亂的重要環(huán)節(jié)。免疫學(xué)研究表明，銀消顆粒抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞產(chǎn)生TNF－α、IL－18，促進ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生IL－10。但是銀消顆粒對細胞因子的抑制作用具有不均衡性，對小鼠巨噬細胞產(chǎn)生的IL－18抑制作用最強，在低濃度時即與甲氨喋呤組無顯著差異。而對TNF－α的作用稍弱，在中、高劑量時才與甲氨喋呤組無顯著差異。因此銀消顆?？赡芡ㄟ^雙向調(diào)節(jié)銀屑病患者的免疫功能狀態(tài)，抑制Th1型細胞因子，促進Th2型細胞因子模式的發(fā)展，調(diào)節(jié)Th1/TH2的平衡，多靶點有效治療銀屑病。如何利用中藥選擇性誘導(dǎo)或調(diào)控Th1/Th2細胞的動態(tài)平衡，對進一步分析中醫(yī)藥治療銀屑病的機制，篩選有效的方藥，進而提取有效成分有重要意義。

［1］ 朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實驗方法［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2000:192 －231.

［2］ Pietrzak A，Lecewicz－torun B，Chodorowska G.Interleukin－18 levels in the plasma of psoriatic patients correlate with the extent of skin lesions and the PASI Score［J］.Acta Derm Venereol，2003，83(4):262－265.

［3］ Farkas A，Kemeny L，Szony BJ，et al.Dithranall upregulates IL －10receptors on the cultured human keratinocyte cell line Ha CaT［J］.Inflam Res，2001，50(1):44 －49.

［4］ Seifert M，Seerry W，berger E，et al.The antipsoriatic activity of IL －10 is rather caused by effects on peripheral blood cells than by a direct effect on human keratinocytes［J］.Arch Dermatol Res，2000，292(4):164－172.

［5］ 李志鴻，金娟.涼血解毒方治療尋常型銀屑病血熱證的臨床觀察［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(3):135 －136.