鹽酸川芎嗪滴眼液在兔眼房水中的藥動(dòng)學(xué)研究

何梅鳳， 鄧新國(guó)，2*， 吳 偉， 高 楊，2

(1．中山大學(xué)中山眼科中心;2．中山大學(xué)眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510060)

川芎嗪是從中藥川芎的根莖中提取的有效成分，具有擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、改善組織微循環(huán)、抗脂質(zhì)過氧化、抗自由基、Ca2+阻滯、抗組織纖維化等藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛［1-2］。近年來，其在眼科疾病的防治也取得了一定的療效，具有較好的應(yīng)用前景［3-4］。有研究［5］表明，川芎嗪經(jīng)腹腔注射后能進(jìn)入兔眼組織，但存在眼內(nèi)組織消除快的缺點(diǎn)，而全身用藥的次數(shù)又受患者的依從性和藥物不良反應(yīng)等因素的影響，從而使其在眼科臨床使用受到一定的影響。因此，將其開發(fā)成眼局部應(yīng)用劑型具有重要的意義。目前，國(guó)內(nèi)外還未見有關(guān)川芎嗪局部滴眼后眼內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的報(bào)道，本研究通過鹽酸川芎嗪局部應(yīng)用兔眼后，考察其房水藥代動(dòng)力學(xué)情況，為川芎嗪眼局部應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1．1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，包括G1314A紫外檢測(cè)器，G1316A柱溫箱，G1329A帶溫控自動(dòng)進(jìn)樣器，G1311A四元泵，G1322A真空脫氣機(jī)(美國(guó)安捷倫公司);Agilent 1100化學(xué)工作站;離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1．2 試藥 鹽酸川芎嗪對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110817-200305);鹽酸川芎嗪原料藥(西安力邦制藥有限公司，批號(hào):061001B);鹽酸川芎嗪滴眼液(自制，5 mL∶25 mg);玻璃酸鈉(山東福瑞達(dá)生物化工有限公司，批號(hào):0508111);甲醇為色譜純，其它試劑為分析純。

1．3 動(dòng)物 新西蘭白兔27只，健康無眼疾，雌14只，雄13只，體質(zhì)量2．0～2．4 kg，由廣東醫(yī)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將27只新西蘭白兔，隨機(jī)分為9組，每組3只(6眼)。

2．2 給藥及樣品采集方法 將家兔固定在兔箱內(nèi)，輕輕拉開眼瞼使與眼球成袋狀，用微量加樣器滴入鹽酸川芎嗪滴眼液50μL，再輕輕放開下眼瞼，使藥物不會(huì)溢出。給藥后，分別于 0、2．5、5、15、30、60、120、180、240 min采取耳緣靜脈空氣栓處死家兔，立即抽取房水150μL置1．5 mL離心試管中，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2．3 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18不銹鋼柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(62 ∶38)，體積流量0．9 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為20℃，進(jìn)樣量40μL。

2．4 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取鹽酸川芎嗪對(duì)照品8 mg，以甲醇為溶媒定容于10 mL量瓶，即得質(zhì)量濃度為0．8 mg/mL的對(duì)照品貯備液，密封放冰箱備用。對(duì)照品工作液在使用前由以上貯備液稀釋制得。

2．5 樣品處理 分別取不同時(shí)間組白兔房水各150 μL，解凍后，旋渦振蕩1 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液100μL，加入100μL色譜甲醇，旋渦振蕩1 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，進(jìn)樣40μL。

2．6 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2．6．1 方法專屬性 在以上色譜條件下，鹽酸川芎嗪的保留時(shí)間為6．7 min，與眼組織中內(nèi)源性物質(zhì)及其它雜質(zhì)分離良好。色譜圖見圖1。

圖1 鹽酸川芎嗪色譜圖Fig．1 Chromatogram of ligustrazine hydrochloride

2．6．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取空白房水適量，與上述對(duì)照品貯備液稀釋制得的不同質(zhì)量濃度對(duì)照品工作液適量混合，配制成鹽酸川芎嗪質(zhì)量濃度為40、20、10、2、1、0．5、0．25 和 0．025 μg/mL 的空白房水川芎嗪溶液，按2．5項(xiàng)方法進(jìn)行處理進(jìn)樣，將峰面積值(A)對(duì)濃度值(C)作線性回歸，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:C=0．009 43A －0．027 08，r=0．999 9，表明鹽酸川芎嗪在質(zhì)量濃度為20～0．012 5μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．6．3 回收率和精確度試驗(yàn) 精密稱取鹽酸川芎嗪對(duì)照品適量，分別配制 0．25、2．00 和 20．00 μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度的鹽酸川芎嗪空白房水液，按2．5項(xiàng)下操作并進(jìn)行分析，求得鹽酸川芎嗪在空白房水中的回收率。在同一天和5 d間(每天一批)對(duì)以上3個(gè)質(zhì)量濃度的鹽酸川芎嗪空白房水液分別處理5批后進(jìn)樣分析，分析日內(nèi)和日間的RSD。房水中鹽酸川芎嗪低、中、高3種濃度回收率及精密度結(jié)果見表1。

表1 兔眼房水中鹽酸川芎嗪回收率和精密度(n=5)Tab．1 Recovery and accuracy of ligustrazine hydrochloride in the humor aqueous of rabbits(n=5)

2．6．4 穩(wěn)定性考察 精密稱取鹽酸川芎嗪對(duì)照品適量，分別配制0．25、2．00 和 20．00 μg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度的鹽酸川芎嗪空白房水液，分別考察樣品于冰箱 －20 ℃存放0、2、4、8、12 d 后，樣品經(jīng)處理放置0、4、8、12、24 h 后鹽酸川芎嗪的穩(wěn)定性。結(jié)果 3 個(gè)質(zhì)量濃度的RSD＜8%，表明樣品在12 d內(nèi)冰凍保存穩(wěn)定，處理后24 h內(nèi)進(jìn)樣分析不影響結(jié)果。

2．7 房水中鹽酸川芎嗪的濃度 兔眼局部滴用鹽酸川芎嗪滴眼液后，川芎嗪能快速進(jìn)入兔眼房水，5 min達(dá)高峰，然后逐漸下降，在4 h其濃度已非常低。具體結(jié)果見圖2。

圖2 兔眼滴用鹽酸川芎嗪滴眼液后房水的藥時(shí)曲線Fig．2 Mean concentration-time curves of ligustrazine hydrochloride in aqueous humor of rabbits after topical adm inistration

2．8 房水中的藥代動(dòng)力學(xué)模型擬合及相關(guān)參數(shù)鹽酸川芎嗪滴眼液局部應(yīng)用后在兔眼房水中的房室模型及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用DSA2．1．1版軟件進(jìn)行擬合。結(jié)果表明，鹽酸川芎嗪濃度在正常白兔房水中呈二室模型，達(dá)峰時(shí)間快，峰濃度較高，但消除也較快。具體藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。

表2 兔眼局部滴用鹽酸川芎嗪后鹽酸川芎嗪在房水中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)( ± s，n=6)Tab．2 The pharmackinetic parameters of ligustrazine hydrochloride in aqueous humor of rabbits after topical adm inistration( ± s，n=6)

表2 兔眼局部滴用鹽酸川芎嗪后鹽酸川芎嗪在房水中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)( ± s，n=6)Tab．2 The pharmackinetic parameters of ligustrazine hydrochloride in aqueous humor of rabbits after topical adm inistration( ± s，n=6)

參數(shù) 參數(shù)值T max/h 0．083 ±0．000 C max/(μg/mL)16．202 ±2．565 t1/2α/h 0．509 ±0．179 t1/2β/h 0．857 ±0．278參數(shù) 參數(shù)值MRT/h 0．682 ±0．048 AUC/(μg·h/mL) 14．584 ±2．950 V/F/L 1．234 ±0．170 CL/(L/h)1．418 ±0．277

3 討論

由于眼內(nèi)容物的容量有限，可供采集的標(biāo)本量較少，因此，測(cè)定眼組織中某藥物成分時(shí)，選擇的檢測(cè)方法要求有足夠的靈敏度。在含川芎嗪的生物樣本中，選用甲醇-水作為流動(dòng)相測(cè)定血中川芎嗪已有報(bào)道，對(duì)樣本的處理以往多選用二氯甲烷或三氯甲烷［6-7］，近年也有采用甲醇、甲醇和二氯甲烷混合溶液、乙腈或非那西丁乙腈溶液處理生物樣本后對(duì)鹽酸川芎嗪進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道［5，8-10］。本實(shí)驗(yàn)先將房水樣本經(jīng)高速離心，再經(jīng)甲醇簡(jiǎn)單處理后，采用高效液相色譜法測(cè)定川芎嗪濃度，比單一離心或甲醇處理樣本沉淀蛋白質(zhì)更完全，雜質(zhì)峰更少，且樣品稀釋比(1∶1)好，日內(nèi)、日間變異小，回收率大于95%。結(jié)果表明，該方法具有特異、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于對(duì)房水中川芎嗪的測(cè)定。

目前，臨床應(yīng)用的川芎嗪制劑主要是注射劑、片劑及膠囊劑，國(guó)內(nèi)外尚未見有川芎嗪眼用制劑的報(bào)道。本研究，我們將鹽酸川芎嗪制成滴眼液，并通過鹽酸川芎嗪滴眼液?jiǎn)蝿┝康斡猛醚酆?，采用高效液相色譜法測(cè)定了不同時(shí)間房水中的川芎嗪，考察了其眼內(nèi)吸收和代謝情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其質(zhì)量濃度在正常白兔房水呈二室模型，川芎嗪局部應(yīng)用兔眼后，具有較強(qiáng)的眼內(nèi)穿透性，能快速進(jìn)入兔眼房水，5 min達(dá)峰濃度，而消除也較快，4 h其濃度已非常低。此結(jié)果與以往研究報(bào)道［5］的川芎嗪經(jīng)腹腔注射后在房水中的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)相比，眼局部用藥后在房水的達(dá)峰時(shí)間較快，消除速度也稍快。因此，將川芎嗪制成眼局部用緩釋制劑，延長(zhǎng)其在眼內(nèi)的滯留時(shí)間，是一項(xiàng)值得進(jìn)一步探討的課題。

［1］李 勤，李秉芝，劉 宏．川芎嗪注射液的藥理作用和臨床應(yīng)用［J］．醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(10):1402-1405．

［2］聞智鳴．川芎嗪、丹參、銀杏達(dá)莫注射液治療糖尿病腎病的探討［J］．中成藥，2005，27(12):1421-1423．

［3］葉明花．近五年川芎嗪眼科應(yīng)用研究概述［J］．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，18(3):78-80．

［4］何梅鳳，吳 偉，鄧新國(guó)．川芎嗪在眼科應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］．中草藥，2007，38(8):附 4-6．

［5］鄧新國(guó)，張清炯，賈小蕓，等．川芎嗪全身用藥在兔眼不同部位的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較［J］．藥物分析雜志，2006，26(6):721-725．

［6］張竟超，董偉林．高效液相色譜法測(cè)定血中磷酸川芎嗪的濃度［J］．天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，6(1):34-35．

［7］馮 悅，王錦玲，馬宏敏．川芎嗪在豚鼠血液、腦脊液和耳蝸外淋巴液中的分布［J］．聽力學(xué)及言語疾病雜志，2004，12(2):101-103．

［8］Li L L，Zhang Z R，Gong T，et al．Simultaneous determination of gastrodin and ligustrazine hydrochloride in dog plasma by gradient high-performance liquid chromatography［J］．JPharm Biomed A-nal，2006，41(4):1083-1087．

［9］張國(guó)平，郭 瑩，張 莉，等．灌胃養(yǎng)陰通腦顆粒大鼠血漿中川芎嗪的 HPLC 法測(cè)定［J］．中草藥，2007，38(5):690-692．

［10］耿新輝，陳方劍，于晶晶，等．磷酸川芎嗪滴丸藥物動(dòng)力學(xué)研究［J］．蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，32(4):403-405．