馬錢(qián)子堿及生物轉(zhuǎn)化氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎毒性的研究

張啟春， 楊雨微， 卞慧敏

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理教研室，江蘇南京210029)

斑馬魚(yú)具有產(chǎn)卵多、性周期短、易于飼養(yǎng)等特點(diǎn)，其胚胎體外受精和發(fā)育，胚胎透明，便于鏡下觀(guān)察形態(tài)變化。近年來(lái)，斑馬魚(yú)作為一種模式動(dòng)物越來(lái)越多地應(yīng)用于發(fā)育和毒理學(xué)研究［1-2］。但就斑馬魚(yú)在中藥研究中應(yīng)用的報(bào)道尚不多見(jiàn)。

馬錢(qián)子作為散血熱、消腫、止痛的藥物，具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、興奮中樞等作用，用于風(fēng)濕頑痹、麻木癱瘓、癰疽腫痛等癥［3-4］。馬錢(qián)子堿(brucine，B)既是馬錢(qián)子有效成分，又是毒性成分，其治療劑量和中毒劑量接近。馬錢(qián)子堿中毒主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性。故馬錢(qián)子多以炮制品入藥，炮制過(guò)程中馬錢(qián)子堿可轉(zhuǎn)化為馬錢(qián)子堿氮氧化物(brucine N-oxide，BN)。炮制后的氮氧化物毒性?xún)H分別為前化合物的1/15，中毒潛伏期顯著延長(zhǎng)［5］。

本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，通過(guò)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程的觀(guān)察，評(píng)價(jià)馬錢(qián)子堿及生物轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物馬錢(qián)子堿氮氧化物對(duì)胚胎發(fā)育影響的差異，同時(shí)為中藥毒理評(píng)價(jià)嘗試一種新的方法。

1 材料

1．1 魚(yú)種的飼養(yǎng)及受精卵收集 將成年野生型A×B品系斑馬魚(yú)飼養(yǎng)在經(jīng)活性碳處理、紫外線(xiàn)消毒并經(jīng)充分曝氣的養(yǎng)魚(yú)用水內(nèi)。水溫保持(28±1)℃，pH 值為(8．0 ±0．3)，溶解氧量 5 ～10 mg/L，總硬度68 mg/L(以 CaCO3計(jì))，總氨量 ＜0．1mg/L。實(shí)驗(yàn)室光照-黑暗周期為14 h∶10 h。

雌魚(yú)交配后在魚(yú)卵收集器產(chǎn)生受精卵，2 h后將受精卵用虹吸管取出，用蒸餾水、培養(yǎng)液清洗魚(yú)卵以除去糞便等雜物。收得魚(yú)卵后放入魚(yú)卵孵化液中。受精卵發(fā)育6 h，解剖顯微鏡下挑選出正常的并已達(dá)到囊胚期的斑馬魚(yú)受精卵放入24孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2 試劑與儀器 馬錢(qián)子堿，日本和光純藥株式會(huì)社;馬錢(qián)子氮氧化物，南京中醫(yī)藥大學(xué)潘揚(yáng)教授惠贈(zèng);吖啶橙，Tricaine，Sigma 公司;Hank’s液:0．137 mol/L 氯化鈉，5．4 mol/L 氯化鉀，0．25 mmol/L 磷酸氫二鈉，0．44 mmol/L 磷酸二氫鉀，1．3 mmol/L 氯化鈣，1．0 mmol/L硫酸鎂，4．2 mmol/L 碳酸氫鈉;SZX9解剖顯微鏡，正置熒光顯微鏡，OLYMPUS。

2 方法

LC50觀(guān)察:配制馬錢(qián)子堿 10 000、5 000、3 000、2 000、1 000、500、200、100 μmol/L 質(zhì)量濃度，馬錢(qián)子堿氮氧化物 20 000、10 000、5 000、2 000、1 000、500μmol/L質(zhì)量濃度。將收集的受精卵浸入上述含不同質(zhì)量濃度藥物的培養(yǎng)液中，進(jìn)行24、96 h連續(xù)培養(yǎng)。

孵化率、存活率及形態(tài)學(xué)觀(guān)察:將斑馬魚(yú)受精卵浸入含 2 000、1 000、500、200、100 μmol/L 馬錢(qián)子堿及其氮氧化物的溶液中，觀(guān)察72 h孵化率;以100 μmol/L質(zhì)量濃度觀(guān)察 24、48、72、96 與 120 h 存活率;200 μmol/L 質(zhì)量濃度下，分別觀(guān)察 24、36、48、72 h形態(tài)變化。

凋亡檢測(cè):培養(yǎng)96 h后斑馬魚(yú)吖啶橙染色，熒光顯微鏡觀(guān)察;另培養(yǎng)24 h受精卵，胰酶消化，吸管吹散混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，機(jī)率單位加權(quán)回歸法(Bliss法)法用以計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50)。

4 結(jié)果

4．1 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)的LC5024 h馬錢(qián)子堿、馬錢(qián)子堿氮氧化物L(fēng)C50分別為 1．81、25．827 mmol/L，96 h 馬錢(qián)子堿、馬錢(qián)子堿氮氧化物 LC50分別為 0．364、3．646 mmol/L。結(jié)果表明，馬錢(qián)子堿對(duì)斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)的毒性大于馬錢(qián)子堿氮氧化物，前者LC50是后者的10～15倍(結(jié)果見(jiàn)表1～2)。

表1 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎LC50(24 h)Table．1 LC50 of brucine and brucine N-oxide tozebrafish embryos(24 h)

4．2 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的影響 與對(duì)照組比較，在2 000、1 000、500、200、100μmol/L質(zhì)量濃度下，馬錢(qián)子堿組孵化率均存在明顯降低，馬錢(qián)子堿氮氧化物組孵化率均高于相應(yīng)濃度的馬錢(qián)子堿組;而馬錢(qián)子堿氮氧化物組僅在2 000、1 000、500 μmol/L質(zhì)量濃度下，與對(duì)照組(C)相比有孵化率顯著降低。馬錢(qián)子堿及其氮氧化物在較高質(zhì)量濃度2 000、1 000μmol/L孵化率間的差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(結(jié)果見(jiàn)圖1，B:馬錢(qián)子堿;BN:馬錢(qián)子堿氮氧化物;C:對(duì)照)。

圖1 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的影響 ± s，n=10)Fig．1 Effect of brucine and brucine N-oxide on hatching rate of zebrafish embryo( ± s，n=10)

4．3 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎成活率的影響 用500μmol/L的馬錢(qián)子堿及其氮氧化物處理斑馬魚(yú)胚胎，馬錢(qián)子堿氮氧化物組斑馬魚(yú)胚胎成活率在觀(guān)察的各時(shí)間點(diǎn)均高于馬錢(qián)子堿組，其差異在24及48 h時(shí)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(結(jié)果見(jiàn)圖2，B:馬錢(qián)子堿;BN:馬錢(qián)子堿氮氧化物)。

圖2 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎成活率的影響( ± s，n=10)Fig．2 Effect of brucine and brucine N-oxide on survival rate of zebrafish embryo( ± s，n=10)

4．4 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響 正常組魚(yú)卵發(fā)育正常，48 h部分開(kāi)始破膜，72 h已孵化成幼魚(yú)。用200μmol/L的馬錢(qián)子堿處理后的魚(yú)卵發(fā)現(xiàn)有脊柱側(cè)彎，心包水腫，黑色素少等現(xiàn)象;用相同濃度的馬錢(qián)子堿氮氧化物處理斑馬魚(yú)卵，沒(méi)有觀(guān)察到上述發(fā)育異?，F(xiàn)象。當(dāng)馬錢(qián)子堿氮氧化物濃度增加到1 000μmol/L時(shí)，有個(gè)別魚(yú)卵出現(xiàn)了脊柱側(cè)彎，心包水腫等現(xiàn)象(見(jiàn)圖3)。

圖3 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響(n=10)Fig．3 Effect of brucine and brucine N-oxide on developm ent of zebrafish em bryo(n=10)

4．5 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞凋亡的影響 吖啶橙染色后觀(guān)察到馬錢(qián)子堿氮氧化物組斑馬魚(yú)除了眼睛晶狀體上有少量熒光表達(dá)外其它部位無(wú)明顯熒光表達(dá);馬錢(qián)子堿組斑馬魚(yú)染色后熒光表達(dá)明顯，主要表現(xiàn)在頭部(大腦、小腦)、腹部、眼睛晶狀體、視網(wǎng)膜。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，馬前子堿組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，而馬錢(qián)子堿氮氧化物組雖然與對(duì)照組比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其顯著低于馬錢(qián)子堿組;馬錢(qián)子堿組G1、C2期細(xì)胞比例高于對(duì)照組與馬錢(qián)子堿氮氧化物組，而S期細(xì)胞比例則低于后兩者，但未觀(guān)察到組間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)圖4～5，表3;B:馬錢(qián)子堿;BN:馬錢(qián)子堿氮氧化物;C:對(duì)照)。

圖4 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞凋亡的影響(n=3)Fig．4 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis of zebrafish embryo(n=3)

表3 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎24 h細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響( ± s，n=3)Table．3 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis and cell cycle of zebrafish embryo( ± s，n=3)

表3 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎24 h細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響( ± s，n=3)Table．3 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis and cell cycle of zebrafish embryo( ± s，n=3)

與對(duì)照組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;B 與 BN 比較，##P ＜0．01。*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs control group;##P ＜0．01 B vs BN．

組別 例數(shù) 劑量/(μmol/L) 凋亡率/% 細(xì)胞周期分布/%G1期 G2期 S期對(duì)照 3 － 0．11 ± 0．08 59．95 ± 1．61 7．09 ± 1．78 32．96 ± 3．32馬錢(qián)子堿 3 200 3．73 ±1．67＊＊ 71．84 ±12．92 11．79 ± 2．45 16．36 ±15．36馬錢(qián)子堿氮氧化物 3 200 0．54 ±0．19*##54．75 ± 7．71 8．78 ± 4．73 36．47 ± 10．36

圖5 馬錢(qián)子堿及其堿氮氧化物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎24h細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響(n=3)Fig．5 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis and cell cycle of zebrafish embryo(n=3)

5 討論

斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育的動(dòng)態(tài)表現(xiàn)為［6］:斑馬魚(yú)受精卵為圓形，50 min左右開(kāi)始卵裂，以后每15～20 min左右卵裂一次;2．5 h后胚胎進(jìn)入囊胚期，可見(jiàn)胚盤(pán)象一頂帽子蓋在卵黃的表面;15 h后，逐漸發(fā)育為幼魚(yú)。破膜前的幼魚(yú)頭尾相對(duì)曲臥于膠膜中，腹側(cè)“抱著”卵黃。其眼球黑色，背腹部黑色素細(xì)胞呈斑塊狀，心臟為紡錘形的囊，節(jié)律性心跳明顯，血液由心臟泵出，通過(guò)耳囊深部沿背血管流向體后，然后折轉(zhuǎn)向前腹部，向前穿過(guò)卵黃流回心臟。消化道、泄殖孔清晰可見(jiàn)，尾鰭寬大，耳囊呈薄膜狀，內(nèi)可見(jiàn)兩個(gè)黑色小圓點(diǎn);72 h后，正常發(fā)育的幼魚(yú)尾部劇烈擺動(dòng)破膜先出，之后整個(gè)魚(yú)體出膜。出膜的幼魚(yú)體長(zhǎng)約4 mm左右;1 d后常到水面游動(dòng)，1周后開(kāi)始捕食。但由于外界溫度條件的不同，整個(gè)胚胎的發(fā)育過(guò)程會(huì)有所差異。

斑馬魚(yú)魚(yú)卵常年可得，透明度高，發(fā)育迅速，特征明顯，便于觀(guān)察。斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)與傳統(tǒng)的成魚(yú)急性毒性實(shí)驗(yàn)相比，具有成本低、影響因素少、易于重復(fù)性和靈敏度高等的特點(diǎn)，而且生命早期發(fā)育階段通常對(duì)毒性作用最敏感。胚胎毒性實(shí)驗(yàn)成為成魚(yú)急性毒性試驗(yàn)的有效替代手段［7］。不同作用機(jī)理的化合物在不同胚胎發(fā)育階段內(nèi)不僅毒性作用表征不同，且敏感度也會(huì)有所改變［8］。所以研究不同發(fā)育階段的毒性效應(yīng)可以為化合物毒理評(píng)價(jià)研究提供特殊的信息，如毒物最敏感的毒理學(xué)指標(biāo)和最關(guān)鍵的暴露時(shí)間等［9］。斑馬魚(yú)對(duì)藥物毒性作用呈現(xiàn)出與哺乳動(dòng)物可比的反應(yīng)。一般藥物毒性研究包括急性單個(gè)劑量試驗(yàn)、亞慢性多個(gè)劑量組試驗(yàn)、慢性毒劑量試驗(yàn)。除了利用斑馬魚(yú)進(jìn)行了一般毒性實(shí)驗(yàn)外，還能就如血管發(fā)生、神經(jīng)毒性、肝毒性、軟骨發(fā)育、生殖毒性、發(fā)育毒性、腫瘤發(fā)生等進(jìn)行研究［10-14］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在斑馬魚(yú)胚胎期和斑馬魚(yú)幼魚(yú)期，馬錢(qián)子堿的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于馬錢(qián)子堿氮氧化物。馬錢(qián)子堿的半數(shù)致死量是馬錢(qián)子堿氮氧化物的10～15倍。對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的觀(guān)察結(jié)果證實(shí)了生物轉(zhuǎn)化后的馬錢(qián)子堿氮氧化物毒性亦明顯低于馬錢(qián)子堿，與斑馬魚(yú)急性毒性實(shí)驗(yàn)一致。由此可見(jiàn)，斑馬魚(yú)作為一種模式動(dòng)物，一種可實(shí)現(xiàn)高通量操作的脊椎動(dòng)物，在中藥毒性評(píng)價(jià)上有著非常重要的意義。

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