一枝黃花高效液相指紋圖譜研究

茅向軍， 許乾麗， 鮑家科， 林瑞超， 戴 忠

(1．貴州省藥品檢驗所，貴州貴陽550004;2．中國藥品生物制品檢定所，北京100050)

一枝黃花為菊科植物一枝黃花Solidago decurrens Lour．的干燥全草。秋季花果期采挖，除去泥沙，曬干。具有清熱解毒，疏散風熱的功效。用于喉痹，乳蛾，咽喉腫痛，瘡癤腫毒，風熱感冒［1-2］。本品也為貴州省少數(shù)民族用藥［3］。據(jù)報道［4-5］，一枝黃花中主要含黃酮類、皂苷類等成分。黃酮類化合物，已鑒定的成分有:蘆丁、山柰酚-3-蘆丁糖苷、異槲皮苷、山柰酚-葡萄糖苷等。對一枝黃花指紋圖譜的研究尚未見報道。為了更好地評價一枝黃花藥材質(zhì)量均勻性和穩(wěn)定性，提高其質(zhì)量控制標準，本實驗收集了不同產(chǎn)地的一枝黃花藥材，采用高效液相色譜法，建立了一枝黃花藥材的指紋圖譜分析方法。

1 儀器與材料

1．1 儀器與試劑 島津LC-20A液相色譜儀，LC solution色譜工作站，二級管陣列檢測器，恒溫柱箱，自動進樣器;《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》(國家藥典委員會)。

蘆丁(批號:100080-200707)，綠原酸(批號:110753-200413)對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供，供定量測定用，乙腈和甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1．2 藥材 10批樣品采自貴州、四川、浙江、福建等地，由貴陽中醫(yī)學院陳德媛研究員鑒定為菊科植物一枝黃花Solidago decurrens Lour．的干燥全草。

2 方法與結果

2．1 色譜條件 Shimadzu VP-ODSC18色譜柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);柱溫 30℃;乙腈 －0．4%磷酸(70∶30)為A流動相，0．4%磷酸為B流動相，進行線性梯度洗脫，0～25 min，A由7%線性改變至28%，25～40 min，A 線性改變至35%，40～50 min，A線性改變至64%，50～60 min，A線性改變至100%，保持至70 min;檢測波長285 nm;體積流量:1 mL/min;進樣量10μL。理論板數(shù)按綠原酸計不低于4 000，按蘆丁計不低于6 000，色譜圖見圖1。

圖1 一枝黃花的HPLC圖譜Fig．1 HPLC chromatograms of Solidaginis Herba

2．2 對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸和蘆丁對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0．022 6、0．020 69 mg/mL 的溶液，即得。

2．3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過3號篩)，精密稱取2 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流40 min，取下，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜(0．45μm)濾過，即得。

2．4 方法學考察

2．4．1 精密度實驗 取同一供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，測定峰面積并記錄色譜圖，結果17個共有峰保留時間和峰面積RSD均小于3%，保留時間和峰面積值均無明顯變化，符合指紋圖譜技術要求。

2．4．2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于 0、2、6、10、14、18 h 各測定一次。結果17個共有峰的保留時間的RSD均在0．3%以內(nèi)，峰面積值的RSD均小于3．0%。說明供試品溶液至少在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．4．3 重復性試驗 精密稱取同一批號一枝黃花6份，按2．3項下方法制備供試品溶液，測定。結果其色譜峰保留時間的RSD均在0．3%以內(nèi)，峰面積的RSD均在5%以內(nèi)。

2．4．4 主要色譜峰的建立 分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄60 min的色譜圖。檢測指認，結果10批一枝黃花藥材的指紋圖譜，與對照品綠原酸和蘆丁的色譜峰相對應的位置上有主要色譜峰，兩峰峰面積之和約占總峰面積20%左右。60 min內(nèi)10批樣品有17個共有峰。在2、7、11、14號峰(保留時間約在15．5、27．2、32．0 和 40．7 min)的位置更具特征性，為主要共有峰，2號峰對應為綠原酸的色譜峰，7號峰對應為蘆丁的色譜峰。因此，最終確定了17個色譜峰為共有指紋峰，見圖1，以7號峰蘆丁峰為參比計算，共有指紋峰的相對保留時間見表1，主要共有峰峰面積百分數(shù)見表2。

2．4．5 樣品指紋圖譜相似度分析 將10批藥材按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行分析，記錄HPLC色譜圖，并使用國家藥典委員會《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004年A版軟件進行處理，得到標準指紋圖譜。見圖2，表3。

由以上結果可知10批一枝黃花藥材的HPLC圖譜的相似度均大于0．8，基本符合中國藥典中藥質(zhì)量標準研究制定技術要求，所建立的一枝黃花HPLC對照指紋圖譜合格，可作為當?shù)厮幉牡臉藴蕡D譜。

圖2 10批一枝黃花的HPLC指紋圖譜Fig．2 HPLC fingerprint chromatogram for ten batches of Solidaginis Herba

3 小結與討論

實驗結果顯示一枝黃花S4、S5、S7和S8號樣品相似度均達到0．90以上，說明這4批藥材的指紋圖譜具有較高的相似性，其余樣品相似度較低，可能與采收時間和成熟程度等因素有關，也說明了中藥材成分的復雜性。另外，由于樣品采集的地點較少，同一產(chǎn)地的樣品數(shù)也較少，因此，產(chǎn)地與樣品相似度的關系有待進一步的研究。

表1 10批一枝黃花樣品共有指紋峰的相對保留時間Tab．1 Relative retention time of common fingerprint peaks for ten batches of Solidaginis Herba

表2 一枝黃花指紋圖譜主要指紋峰面積的相對百分數(shù)Tab．2 Relative percentage content ofmain fingerprint peak areas in HPLC fingerprint chromatogram for Solidaginis Herba

表3 10批一枝黃花藥材的相似度結果Tab．3 Sim ilarity evaluation results for ten batches of Solidaginis Herba

在色譜條件優(yōu)化過程中，考察了甲醇－0．4%磷酸，甲醇 －0．4% 醋酸，乙腈 －0．4%磷酸，乙腈－0．4%磷酸，乙腈-甲醇 －0．4% 磷酸，乙腈-甲醇－0．4%醋酸等系統(tǒng)，最后確定了乙腈－0．4%磷酸系統(tǒng)梯度洗脫的條件，該系統(tǒng)比其它系統(tǒng)分離度好，峰形對稱性好，基線穩(wěn)定;采用二極管陣列檢測器對檢測波長進行考察，記錄190～700 nm范圍的HPLC圖譜，用等高線法確定285 nm為檢測波長，在該波長下一枝黃花色譜中色譜峰較多，基線平穩(wěn)，信息豐富。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:1977年版一部［S］．北京:人民衛(wèi)生出版社，1978:1．

［2］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:3．

［3］貴州省藥品監(jiān)督管理局編．貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準(2003年版)［M］．貴陽:貴州科技出版社，2003:4．

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