Pim－3在大鼠脂肪組織中的表達(dá)及其與脂肪胰島素抵抗的關(guān)系*

閔新文， 汪引芳， 錢 航， 任永生， 趙黎丙， 張 鵬，， 馬業(yè)新， 陳華茜△

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科，湖北武漢430030;湖北醫(yī)藥學(xué)院2附屬東風(fēng)醫(yī)院心內(nèi)科，3生理學(xué)教研室，湖北十堰442008)

胰島素抵抗是代謝綜合征的重要組分，是2型 糖尿病產(chǎn)生的主要病因。胰島素抵抗發(fā)生的確切分子機(jī)制仍然不是十分明了。現(xiàn)在已知，胰島素靶器官，如脂肪組織、骨骼肌組織和肝臟組織，對胰島素是否敏感決定了胰島素抵抗發(fā)生與否及抵抗的程度[1，2]。許多研究表明超重和肥胖與胰島素抵抗有密切關(guān)聯(lián)，脂肪組織尤其是內(nèi)臟脂肪組織在胰島素抵抗發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[3，4]。

研究發(fā)現(xiàn)絲、蘇氨酸蛋白激酶參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化及代謝的多個環(huán)節(jié)，從而影響脂肪生成[5]。Pim家族是一類新發(fā)現(xiàn)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，包括Pim－1、Pim－2、Pim－3三種亞型，研究提示Pim－3蛋白在胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等高表達(dá)，其抗凋亡作用可能是多種腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制之一[6－9]。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Pim－3可能涉及調(diào)節(jié)心肌損傷后的細(xì)胞保護(hù)作用及影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖、血管生成的過程[10]。最近研究還發(fā)現(xiàn)Pim－3參與調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的自我更新[11]。我們運(yùn)用RT－PCR技術(shù)檢測Pim－3 mRNA在大鼠全身組織分布，發(fā)現(xiàn)Pim－3 mRNA在脂肪組織中具有較高水平的表達(dá)，而其在脂肪組織中的生物學(xué)作用尚無報(bào)道。本研究旨在觀察Pim－3在脂肪中的表達(dá)，并探討其在脂肪的胰島素抵抗發(fā)生過程中的作用。

材料和方法

1 試劑

試劑DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco);胰蛋白酶、DEPC、胰島素(Sigma);Trizol(Invitrogen);RT 試劑盒(Fermentas);Taq聚合酶、dNTP(TaKaRa);羊抗Pim－3抗體(Santa Cruz Biotechnology);TRITC及FITC標(biāo)記的驢抗羊IgG(Proteintech Group);引物由上海Generay Biotech公司合成。

2 方法

2.1 胰島素抵抗大鼠動物模型的制備 胰島素抵抗大鼠動物模型依照參考文獻(xiàn)制備[12]，取12周齡、體重160－200 g、健康的SD雄性大鼠15只，分為正常組(7只)和胰島素抵抗組(8只)，模型組用含有66%果糖、22%酪蛋白、12%豬油的高糖高脂飼料喂養(yǎng)12周，用OGTT法反映葡萄糖耐量。

2.2 口服糖耐量實(shí)驗(yàn)及胰島素敏感指標(biāo)的檢測造模后，大鼠饑餓12 h，用40%葡萄糖溶液灌胃(1 g/kg)，分別在不同時點(diǎn)取尾靜脈血，用羅康全優(yōu)血糖儀(Roche)檢測血糖水平。采用放射免疫試劑盒(rat insulin RIA kit，Linco)測定空腹胰島素水平。

2.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞 取1只SD大鼠的股骨，用DMEM沖洗骨髓腔，1 200 r/min離心5 mim，棄漂浮脂肪層，用20%FBS的DMEM生長液重懸置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)貼壁的單層細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋率90%時，用含0.125%胰酶和0.2%EDTA的消化液將細(xì)胞調(diào)到1×106/L后種在6孔板各孔內(nèi)，然后給予分化液(地塞米松1 μmol/L，豬胰島素 10 mg/L，碘甲烷100 μmol/L，IBMX 0.25 mol/L)誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的分化。分化14 d后在相差顯微鏡下照相，并加入臨時配置的油紅O稀釋液染色10 min，70%異丙醇分色，鏡下觀察脂肪細(xì)胞的分化效率。

2.4 半定量及熒光實(shí)時定量RT－PCR檢測Pim－3 mRNA表達(dá) 參照試劑盒說明書采用Trizol一步法抽提組織和細(xì)胞總RNA。采用Fermentas公司RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物根據(jù)NCBI基因序列(NM_022602)設(shè)計(jì)，大鼠Pim－3引物序列為:上游引物5＇－ TGTGCCCTGGATACTGATGA －3＇，下游引物5＇－ AAGGCACTCAAAGCAAAGGA －3＇，產(chǎn)物片段 227 bp;以β－actin為內(nèi)參照。瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像掃描系統(tǒng)分析基因?；虿捎脽晒鈱?shí)時定量 RT－PCR，以SYBR Green I與雙鏈DNA分子結(jié)合，發(fā)光指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。

2.5 免疫熒光化學(xué)方法檢測脂肪組織及細(xì)胞中Pim－3蛋白的表達(dá) 細(xì)胞或組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，將組織用 OCT 包埋進(jìn)行冰凍切片(7 μm)，0.3%H2O2浸泡15 min，PBS清洗3次后加0.1%Triton浸泡15 min，，PBS清洗3次后加入3%BSA 37℃封閉1 h，接著以羊抗Pim－3抗體 (1∶100稀釋)37℃孵育1h，PBS清洗3次后以TRITC標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶200稀釋)37℃孵育1h最后以Hoechst 33258做細(xì)胞核染色，免疫熒光顯微鏡下照相，用TRITC標(biāo)記的對應(yīng)抗體顯示陽性著色。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 正常大鼠內(nèi)臟脂肪組織Pim－3 mRNA和蛋白的表達(dá)

RT－PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Pim－3 mRNA表達(dá)于脂肪組織中，見圖1A，而未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄RNA為模板的陰性對照組未見Pim－3 mRNA表達(dá)。免疫熒光化學(xué)法發(fā)現(xiàn)Pim－3蛋白高表達(dá)于正常SD大鼠脂肪組織中，而IgG陰性對照組無陽性著色，見圖1B。

Figure 1.Pim －3 was expressed in adipose.The red soleus(SL)，white extensor digitorum longus(EDL)muscle and epididymis fat were removed from rats.A:the Pim － 3 mRNA expression was examined by RT － PCR analysis.B:epididymis fat was removed.lmmunofluorescent assay was performed with anti－ Pim － 3 antibody.Nuclei were counterstained with Hoechst 33258.The negative control were stained with normal goat lgG only.Representative images were presented.圖1 Pim－3 mRNA和蛋白在正常大鼠內(nèi)臟脂肪組織表達(dá)

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的脂肪細(xì)胞Pim－3 mRNA的表達(dá)

分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，油紅O染色結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化14 d后90%以上的細(xì)胞為分化成熟的脂肪細(xì)胞，見圖2A。RT－PCR分析表明，與未分化的細(xì)胞相比，成熟的脂肪細(xì)胞Pim－3 mRNA的水平明顯增高，見圖2B。Pim－3定位表達(dá)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成熟的脂肪細(xì)胞的胞質(zhì)，見圖2C。

Figure 2.Analysis of Pim －3 mRNA expression in adipocytes.The isolated mesenchymal stem cells(MSCs)from rats were differentiated into adipocytes.A:oil red O staining was performed to confirm the differentiated adipocytes;B:the Pim －3 mRNA expression in MSCs and MSC－derived adipocytes were examined by RT－PCR analysis;C:MSCs and MSCs derived adipocytes were fixed and stained with anti－Pim－3 antibody followed by FITC－or TRITC－conjugated anti－goat secondary antibody.圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的脂肪細(xì)胞Pim－3mRNA表達(dá)

3 胰島素抵抗組大鼠內(nèi)臟脂肪組織中Pim－3 mRNA表達(dá)低于正常對照組

口服糖耐量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在造模后第12周高脂飲食的大鼠糖耐量明顯異常，見圖3A，空腹胰島素水平明顯高于實(shí)驗(yàn)大鼠對照組[(31.98±4.41)mU/L vs(15.12 ±5.22)mU/L，P ＜0.01]，見圖 3B，表明胰島素抵抗大鼠模型制備成功。運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測胰島素抵抗大鼠與對照組附睪脂肪、腎周脂肪中Pim－3 mRNA表達(dá)差異，結(jié)果表明胰島素抵抗組附睪和腎周脂肪Pim－3 mRNA水平明顯降低，見圖3C。

Figure 3.Pim －3 expression in visceral fat from rats with insulin resistance.Glucose tolerance tests were performed by intraperitoneal injection of D －glucose at 2 g·kg－1body weight into rats.A:the OGTT curve of groups fed with either high －fat(HF)diet(n=10;squares)or control diet(n=8;triangles);B:fasting serum insulin levels also increased significantly in the rats fed with HF diet;C:Pim －3 mRNA level in visceral fats was determined by real－ time RT － PCR method.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖3 正常對照組和胰島素抵抗組大鼠內(nèi)臟脂肪組織Pim－3 mRNA表達(dá)

4 胰島素抑制脂肪細(xì)胞中Pim－3 mRNA表達(dá)

用100 nmol/L胰島素處理誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞，結(jié)果顯示胰島素可以抑制脂肪細(xì)胞Pim－3 mRNA表達(dá)，見圖4。

Figure 4.The MSC－derived adipocytes were low－serum starved for 12 h before insulin(100 nmol/L)treatment for indicated time Expression of Pim－3 was analyzed by real－time two－step RT－PCR.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 h.圖4 胰島素抑制脂肪細(xì)胞Pim－3 mRNA表達(dá)

討 論

脂肪組織是脂質(zhì)代謝和胰島素反應(yīng)性糖攝取的一個重要部位。脂肪組織可分泌瘦素、TNF－α、PAI－1、抵抗素、脂聯(lián)素、IL－6、游離脂肪酸等物質(zhì)，參與了2型糖尿病的胰島素抵抗發(fā)病過程。另外脂肪細(xì)胞功能障礙所導(dǎo)致的脂毒性也會增高血糖。這些發(fā)現(xiàn)表明脂肪組織在肥胖相關(guān)性胰島素抵抗和代謝功能障礙中的重要地位。

Pim－3激酶較廣泛地表達(dá)于多種組織細(xì)胞中，前期研究表明其表達(dá)的增強(qiáng)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)Pim－3 mRNA和蛋白水平表達(dá)于附睪脂肪組織、紅色的比目魚肌和白色的趾長伸肌等胰島素敏感組織中。研究表明Pim激酶家族成員蛋白只含有激酶結(jié)構(gòu)域，而缺乏調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，其活性大小不依賴于磷酸化調(diào)節(jié)，而決定于其組織表達(dá)量的多少[13]。Pim－3在脂肪組織中的高表達(dá)提示其可能在脂肪中具有重要作用。但是，最近有研究顯示，Pim蛋白的一些絲氨酸或蘇氨酸殘基也能夠發(fā)生磷酸化調(diào)節(jié)，從而改變其激酶活性[14，15]。

脂肪細(xì)胞凋亡在調(diào)節(jié)脂肪組織穩(wěn)定過程中起到重要作用。在人類和嚙齒類動物，肥胖的特點(diǎn)是白色脂肪組織過多。有報(bào)道惡性腫瘤患者和糖尿病大鼠的脂肪組織退化[16，17]。最近，瘦素和 TNF － α 已被證明能夠抑制脂肪細(xì)胞的增殖并引發(fā)細(xì)胞凋亡進(jìn)程[18，19]。以前的研究發(fā)現(xiàn)，生長因子缺失、輕度熱損傷，可以降低脂肪細(xì)胞Bcl－2/Bax比值，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而在嚙齒類動物，Bcl－2表達(dá)水平高的白色脂肪細(xì)胞比棕色脂肪細(xì)胞不容易受到凋亡刺激[20]。Pim－3被認(rèn)為能磷酸化Bad蛋白并且促進(jìn)Bad蛋白的14－3－3 鏈接和阻止其與 Bcl－xL 的關(guān)聯(lián)[21，22]。所以，Pim－3蛋白的存在表明其具有預(yù)防脂肪細(xì)胞凋亡的潛在保護(hù)作用。

Pim－1和Pim－3也參與控制小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞的增殖與分化。據(jù)報(bào)道，Pim－1和Pim－3在小鼠ES細(xì)胞的自我更新中發(fā)揮重要作用。ES細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時需要Pim－1的參與[11，23]。我們觀察到，在分化為脂肪細(xì)胞時 Pim －3的表達(dá)上調(diào)，提示終末分化的脂肪細(xì)胞不進(jìn)行進(jìn)一步的有絲分裂，Pim－3可能并不具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的功能。因此，進(jìn)一步確定Pim－3是否是脂肪細(xì)胞分化所需尤為重要。最近的研究表明，Pim－3是尤文氏肉瘤/禽類逆轉(zhuǎn)錄病毒－E26(Ewing＇s sarcoma/E－twenty six，EWS/ETS)的靶基因，在 EWS/ETS介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用[24]。細(xì)胞表達(dá)EWS/FLI1顯著增加葡萄糖的利用和乳酸的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)另一個Pim家庭成員Pim－2可促進(jìn)例如葡萄糖的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[25]。有報(bào)道，pim－3敲除小鼠并不表現(xiàn)出嚴(yán)重的表型變異[26]。因此，Pim－3在胰島素敏感組織中的病理生理作用仍需進(jìn)一步探討。

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