應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測停育胚胎或絨毛染色體數(shù)目異常

張寧，閆素文，郝冬梅，徐斌

(解放軍沈陽202醫(yī)院全軍計劃生育優(yōu)生優(yōu)育技術(shù)研究所，遼寧 沈陽 110003)

近年來胚胎停育的發(fā)生率日益增高，成為臨床的常見病和多發(fā)病。胚胎停育是指妊娠早期因某種原因所致胚胎發(fā)育停止，胚胎停育不同于孕中期和孕晚期的流產(chǎn)和過期流產(chǎn)，也有別于早期流產(chǎn)，它是在胎兒尚未形成的時候就停止了發(fā)育。主要通過B超監(jiān)測妊娠囊、胎心和血β－HCG進行診斷。遺傳因素是導(dǎo)致胚胎停育的重要原因，而指導(dǎo)臨床查找遺傳因素最常見的方法是絨毛培養(yǎng)染色體分析［1，2］。停育胚胎絨毛大多已壞死無法達到新鮮、無菌要求，培養(yǎng)的失敗率較高。本文應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù) (fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)對停育胚胎絨毛染色體數(shù)目異常進行快速檢測并評估其臨床應(yīng)用價值，對研究胚胎停育提供一個新的檢測手段。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2010年4月至2011年4月到解放軍第202醫(yī)院全軍計劃生育優(yōu)生優(yōu)育技術(shù)研究所門診就診的66例胚胎停育患者，患者年齡20～40歲，孕周6～12周，符合胚胎停育診斷指征：當(dāng)孕周≥6周無妊娠囊，妊娠囊已≥4 cm超聲看不到胎芽，胎芽的頭臂長度≥1.5 cm無胎心搏動。

1.2 試劑 產(chǎn)前染色體數(shù)目檢測試劑盒為北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司出品，國食藥監(jiān)械 (準(zhǔn))字2009第3400010號。試劑盒包含兩組DNA探針，一組探針為 GLP 13(DLEU2)/GLP 21(DSCR2)，另一組為探針為CSP 18/CSP X/CSP Y。

1.3 絨毛標(biāo)本處理及玻片制備 取絨毛約5mg，用生理鹽水將樣本洗凈，無菌剪刀或鑷子去掉蛻膜組織選取絨毛，盡可能剪碎并注意避免母體細(xì)胞的污染，將不能剪碎的標(biāo)本去除，該操作可在顯微鏡下進行。加入5 ml預(yù)熱至37℃的0.075 M KCl溶液，37℃低滲20 min，期間輕輕吹打懸浮細(xì)胞2～3次，棄上清。緩慢加入2 ml固定液 (甲醇∶冰乙酸=3∶1)進行預(yù)固定，輕輕吹打混勻后1 500 rpm，離心10 min。去上清，加入5 ml固定液，混勻固定，靜置10 min，期間吹打 1次，1 500 rpm。離心10 min，反復(fù)固定2次。去上清，加1 ml冰醋酸消化約1 min，加3 ml甲醇終止消化。離心，去上清，根據(jù)細(xì)胞量加適量固定液混勻后滴片。室溫下過夜或56℃烤片至少2 h使玻片老化。室溫干燥保存。

1.4 FISH雜交 室溫下于2XSSC(pH 7.0)溶液中漂洗玻片5 min。37℃下終濃度0.08 mg/ml胃蛋白酶工作液中消化5 min，可根據(jù)實際情況進行調(diào)整，室溫下于2XSSC(pH 7.0)溶液中漂洗5 min。將玻片依次置于 70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各3min脫水，自然干燥。

甲酰胺變性雜交：將探針混合物置于73℃水浴鍋中變性5 min后迅速置于45～50℃水浴鍋中，雜交前取出。將玻片在 (73±1)℃的變性液中浸泡5min，依次置于預(yù)冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各3 min進行梯度脫水。玻片自然干燥后，置于45～50℃ 烤片機上預(yù)熱2～5 min后與探針雜交。若以下探針混合物尚未完成變性，玻片可置于45～50℃烤片機上較長時間預(yù)熱。將10 μl變性后的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊。將玻片置于預(yù)熱的濕盒中，42℃保溫箱中過夜雜交。

移除蓋玻片，立即放入46℃水浴鍋2×SSC溶液中，漂洗10 min，振蕩1～3 s;將玻片置于46℃水浴鍋0.1%NP－40/2×SSC溶液中，漂洗5 min，振蕩1～3 s;然后將玻片室溫浸泡在70%乙醇中，漂洗3 min，自然干燥。將玻片室溫浸泡在70%乙醇中，漂洗3 min，暗處自然干燥玻片。將15 μl DAPI復(fù)染劑加至目標(biāo)區(qū)域，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10～20 min后觀察。

1.5 13/18/21/X/Y染色體異常 FISH結(jié)果判讀

探針組CSP18/CSPX/CSPY：探針在正常男性細(xì)胞核中顯示1個紅色信號，1個綠色信號和2個藍色信號，在正常女性細(xì)胞核中顯示2個綠色信號和2個藍色信號;探針組GLP13/GLP21：在正常細(xì)胞核中顯示2個紅色信號、2個綠色信號;

每組探針計數(shù)至少100個細(xì)胞;單獨判斷每種指標(biāo)，正常細(xì)胞比例大于90%，提示該指標(biāo)無異常;某指標(biāo)異常細(xì)胞比例大于60%，提示該指標(biāo)異常;單個指標(biāo)異常細(xì)胞比例均小于10%，提示為正常結(jié)果;某種指標(biāo)異常比例介于10%～60%之間，加大觀測樣本細(xì)胞數(shù)目，如實記錄異常細(xì)胞比例 (如：30%細(xì)胞GLP 21 FISH結(jié)果顯示三個信號點)，低于判斷非嵌合體狀態(tài)的異常標(biāo)準(zhǔn) (60%)，出現(xiàn)這種異常的原因可能有胎兒染色體異常嵌合體，胎盤特異性染色體異常嵌合體，母體細(xì)胞污染等，建議遺傳咨詢。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 停育胚胎絨毛染色體核型分類 在66例絨毛樣本中，13、18、21、X 和 Y 數(shù)目異常 20例，占46.97%。正常例數(shù)35例，其中男性19例，女性16例。間異例數(shù)11例，即10% ＜異常率＜60%者。正常率53.0%，異常率30.3%，間異率16.7%。20例異常分析結(jié)果中異常類型所占百分比列于表1。

表1 20例異常絨毛染色體分析

2.2 停育胚胎絨毛染色體FISH圖 (圖1～4)

2.3 停育胚胎性別和異常染色體核型關(guān)系 66例停育胚胎中，女性胚胎34例 (51.5%)，男性胚胎32例 (48.5%);31例染色體異常的胚胎中，女性18例 (58.1%)，男性13例 (41.9%)。無論是在流產(chǎn)胚胎或異常核型胚胎中，女性胚胎發(fā)生停育和染色體異常的比例均高于男性胚胎。

3 討論

由表1所見，在所有異常胚胎中性染色體異常占75%，其中Turner's syndrome 45X(TS 45X)所占比例最高與其他任何一種異常的發(fā)生率相比差異顯著 (P＜0.05)。45X是人類最多的染色體異常疾病之一，占出生女嬰的1/2500，受精卵染色體為45X的占2%，是最常見的不正常受精卵，其能發(fā)育并出生的不到1%，流產(chǎn)胎兒7%為45X。純型TS的產(chǎn)生是因為卵子或精子形成時減數(shù)分裂性染色體不分離的結(jié)果。嵌合型TS(45X /46XX，45X/46XX/47XXX)是因為在受精卵形成后，胚胎細(xì)胞分裂時染色體不分離的結(jié)果。

Iyer等［3］在對 TS胎兒的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，純型TS(45，X)占74%，其余為嵌合型。表1結(jié)果顯示，停育胚胎染色體核型均為純型TS(45，X)。目前，卵母細(xì)胞和精原細(xì)胞究竟哪個在減數(shù)分裂時染色體不分離原因尚不清楚。大部分研究認(rèn)為，TS的X染色體的大部分 (60% ～80%)是來源于母親，Uematsu等［4］采用高多態(tài)標(biāo)記的PCR技術(shù)分析雄激素受體基因甲基化狀態(tài)，檢測了50個具有各種核型狀態(tài)的TS(45，X)患者正常染色體的父源性，數(shù)據(jù)顯示大多數(shù)TS核型是父親減數(shù)分裂錯誤產(chǎn)生不正常的性染色體，在有絲分裂時丟失，最終形成母親染色體占主導(dǎo)地位45X細(xì)胞。Martínez－Pasarell等［5］曾采用 PCR 擴增和三色熒光原位雜交技術(shù)對5個X染色體多態(tài)和3個Y染色體片段進行了分析，共測定了來自TS4個患者父親45 299和8個正常對照組的85 423個精子核，結(jié)果顯示，這四個患者父親表現(xiàn)出XY精子的比例顯著增加 (平均0.22%，0.20% ～0.22%)，對照 (平均0.11%，0.06% ～0.18%)，減數(shù)分裂不分離錯誤增加，而性染色體精子減少。因此，停育胚胎中TS(45，X)占絕大多數(shù)的主要原因是男性精子細(xì)胞染色體發(fā)生了畸變，而這種畸變多為環(huán)境影響所致。這也可能是近年來胚胎停育發(fā)生率持續(xù)上升的重要原因。

通過FISH檢測了停育胚胎絨毛染色體數(shù)目異常，不僅幫助胚胎停育夫婦了解疾病發(fā)生的原因，而且有效地指導(dǎo)孕婦成功妊娠并減輕其心理負(fù)擔(dān)。研究結(jié)果對指導(dǎo)臨床進一步從環(huán)境干擾物對配子和胚胎發(fā)育的影響，指明了一條新途徑－精子染色質(zhì)的損傷，對防止出生缺陷尤其是潛在的出生缺陷具有重要意義。FISH技術(shù)簡單、快速和準(zhǔn)確，對檢測像胚胎停育這種以性染色體數(shù)目異常為主的疾病具有獨到之處。但是由于它只能提供有限的染色體數(shù)目異常信息，不能檢出染色體的結(jié)構(gòu)異常，因此不適于產(chǎn)前診斷。

［1］周從容.自然流產(chǎn)兒的細(xì)胞遺傳學(xué)研究［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，1990，25(2)：89.

［2］李麗莎.57例自然流產(chǎn)胚胎染色體分析［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，1992，9(6)：367.

［3］Iyer NP，Tucker DF，Roberts SH，et al.Outcome of fetuses with Turner syndrome：a 10－year congenital anomaly register based study［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2011 ［Epub ahead of print］

［4］Uematsu A，Yorifuji T，Muroi J，et al.Parental origin of normal X chromosomes in Turner syndrome patients with various karyotypes：implications for the mechanism leading to generation of a 45，X karyotype［J］.Am J Med Genet，2002，111(2)：134 －139.

［5］Martínez－Pasarell O，Nogués C，Bosch M，et al.Analysis of sex chromosome aneuploidy in sperm from fathers of Turner syndrome patients［J］.Hum Genet，1999，104(4)：345 －349.