羅洪強，林茂芳，謝萬灼，傅佳萍，封蔚瑩，湯秋霞

特發(fā)性血小板減少性紫癜 (ITP)是一種自身免疫性疾病，目前認為其發(fā)病與機體的免疫功能紊亂有關(guān)，近年來國內(nèi)外研究提示B淋巴細胞亞群失衡以及細胞凋亡的失常與自身免疫相關(guān)性疾病的關(guān)系密切［1－2］。本研究觀察了 ITP患者外周血液中B1細胞以及藥物治療后對它們的影響，以便進一步闡明該病的發(fā)病機制并對預后做出評估，更有效地運用免疫調(diào)節(jié)手段進行分層治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2007年1月—2010年10月在我院住院治療的94例ITP患者，診斷符合張之南主編的《血液病診斷及療效標準》第3版［3］，排除其他免疫性疾病。其中男29例，女65例;平均年齡47.5歲 (17～64歲)。94例ITP患者中57例為初治 ITP患者 (初治 ITP組)，其中39例對甲潑尼龍治療有效，18例對甲潑尼龍治療無效;37例為難治性ITP患者 (難治性ITP組)。病程6個月～5年，患者均接受過正規(guī)腎上腺糖皮質(zhì)激素治療6周以上［4］，治療后患者的血小板 (PLT)計數(shù) ＜30×109/L，其中7例曾應用長春新堿或環(huán)磷酰胺治療，6例曾用丙種球蛋白治療，5例行脾切除術(shù)。治療前皮膚均有不同程度的出血點或瘀斑，月經(jīng)過多8例，牙齦滲血6例，鼻出血4例，PLT(9～24) ×109/L。選擇同期在我院進行健康體檢正常者20例為對照組，男8例，女12例;平均年齡44.2歲 (21～65歲)。

1.2 觀察指標 外周血CD+19細胞、B1細胞、血小板相關(guān)免疫球蛋白 (PAIgG)、PLT計數(shù)。

1.3 檢測方法 (1)試劑單克隆抗體CD5－FITC、CD19－PE及陰性對照試劑鼠抗人IgG1－PE均購自法國Immunotech公司。流式細胞儀型號EPICS－XL，為美國Beckman－Coulter公司產(chǎn)品。檢測過程:采用直接免疫熒光法檢測，抽取外周血1.5 ml(抽血后3 h內(nèi)完成檢測)，將EDTA抗凝全血100 μl和 CD5－FITC、CD19－PE單克隆抗體20 μl置于測定管，而在對照管中加入CD19－PE和鼠抗人IgG1各20 μl作為陰性對照，室溫避光孵育15 min，溶血后上機測定，數(shù)據(jù)收集后計算出CD+19細胞 (總B淋巴細胞)及B1細胞(CD5+CD+19細胞)百分率。 (2)PAIgG檢測:用流式細胞儀檢測PAIgG，其中血小板相關(guān)抗體 (鼠抗人IgG)一抗，羊抗鼠IgG(H+L)二抗FITC2F(ab)2以及陰性對照試劑IgG1(mouse) －PE均購自法國Immunotech公司。(3)幽門螺桿菌 (H.pylori)的檢測通過14C尿素呼吸試驗 (UBT)及H.pylori抗體雙陽性確定。

1.4 治療方法 初治ITP組57例，甲潑尼龍針劑量為1～2 mg/kg靜脈滴注，1次/d，待PLT計數(shù)恢復正常后逐漸減量，并改潑尼松片口服維持3～6個月;37例難治ITP組患者抗H.pylori治療前停用所有的免疫抑制劑，治療2周后復查H.pylori和PLT計數(shù)?？笻.pylori治療方法:奧美拉唑20 mg 2次/d+克拉霉素500 mg 2次/d+阿莫西林1 000 mg 2次/d，療程2周。

1.5 PLT療效標準 參照張之南主編的《血液病診斷及療效標準》第三版［3］，(1)顯效:PLT計數(shù)恢復正常，無出血癥狀，持續(xù)＞3個月。維持＞2年無復發(fā)者亦稱基本治愈。 (2)良效:PLT計數(shù)升至50×109/L或較原水平上升＞30×109/L，無或基本無出血癥狀，持續(xù)＞2個月。 (3)進步:PLT計數(shù)有所上升，出血癥狀改善，持續(xù)＞2周。(4)無效:PLT計數(shù)及出血癥狀無改善或惡化。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用 (ITP組治療前CD+19細胞、B1細胞、PAIgG±s)表示，組間比較采用方差分析或兩獨立樣本的t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗。兩變量間關(guān)系采用直線相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組觀察指標比較 3組受檢者治療前外周血CD+19細胞、B1細胞、PAIgG及PLT水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。其中對照組與初治ITP組、難治ITP組治療前CD+19細胞、B1細胞、PAIgG、PLT水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)，而初治ITP組與難治及PLT水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見表1)。

2.2 初治ITP患者甲潑尼龍治療前后觀察指標比較 患者甲潑尼龍治療有效組與無效組患者治療前CD+19細胞、B1細胞、PAIgG水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);治療后兩組上述指標的水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)。治療有效組治療前后CD+19細胞、B1細胞、PAIgG、PLT水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01);而無效組患者治療前后的CD+19細胞、B1細胞、PAIgG、PLT水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表2)。

2.3 難治性ITP患者抗H.pylori治療前后觀察指標比較 抗H.pylori治療前后患者的CD+19細胞、B1細胞、PAIgG、PLT水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表3)。

2.4 ITP患者外周血B1細胞、PAIgG、PLT計數(shù)相關(guān)性 57例初治ITP患者外周血B1細胞與PLT計數(shù)呈負相關(guān) (r=－0.790，P＜0.05);其中B1細胞＜4%共17例，PLT計數(shù)為 (32±5) ×109/L;B1細胞4% ～8% 共26例，PLT計數(shù)為(24±5) ×109/L;B1細胞＞8% 共14例 PLT計數(shù)為 (10±3) ×109/L。B1細胞與 PAIgG呈正相關(guān) (r=0.821，P＜0.05)。外周血PLT計數(shù)與PAIgG呈負相關(guān) (r=－0.754，P＜0.05)。

表1 3組受檢者治療前觀察指標的水平比較 ±s)Table 1 Comparison of the observed indices among the three groups

表1 3組受檢者治療前觀察指標的水平比較 ±s)Table 1 Comparison of the observed indices among the three groups

注;與初治ITP組比較，*P＞0.05;與其他兩組比較，△P＜0.05。PAIgG=血小板相關(guān)免疫球蛋白，PLT=血小板

組別 例數(shù) CD+19細胞(%) B1細胞(%) PAIgG(%) PLT(×109/L)對照組 20 11.1± 7.4△ 2.1±1.2△ 12± 8△ 158±46△初治ITP組 57 21.0±10.0 9.2±5.2 28±19 26± 8難治ITP組 37 21.4± 7.2* 9.2±4.9* 33±14* 18± 9*F＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 4.56 5.37 3.98 6.24 P值值

表2 初治ITP患者甲潑尼龍治療效果與觀察指標水平的關(guān)系 (±s)Table 2 Correlations between curative effects of methylprednisolone and the observed indices in untreated patients

表2 初治ITP患者甲潑尼龍治療效果與觀察指標水平的關(guān)系 (±s)Table 2 Correlations between curative effects of methylprednisolone and the observed indices in untreated patients

注:與治療前比較，*P＜0.05;與治療前比較，△P＞0.05

組別 例數(shù) CD+19細胞 (%)治療前治療后有效組 39 20.8± 9.1 11.1± 4.6* 8.9±15.2 2.5±1.8* 27± 4 13±8* 26±4 216±65治療后B1細胞 (%)治療前 治療后PAIgG(%)治療前 治療后PLT(×109/L)治療前*無效組 18 20.3±10.0 18.7±10.4△ 8.8± 5.3 7.9±5.6△ 31±26 25±3△ 20±5 23± 5△t 0.18 2.97 0.07 4.00 0.65 8.2 4.48 18.43 P值 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01值

表3 難治性ITP患者抗H.pylori治療前后觀察指標比較 (±s，n=37)Table 3 Comparison of the observed indices before and after eradication of H.pylori in refractory patients

表3 難治性ITP患者抗H.pylori治療前后觀察指標比較 (±s，n=37)Table 3 Comparison of the observed indices before and after eradication of H.pylori in refractory patients

抗HP治療 CD+19細胞(%) B1細胞(%) PAIgG(%) PLT(×109/L)21.4±7.2 9.2±4.9 33±14 18± 9治療后 15.3±4.4 4.9±3.6 19± 3 48±12 t治療前2.75 2.15 2.54 3.12 P值值＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01

3 討論

ITP是一種血小板免疫性破壞、外周血中PLT計數(shù)減少的出血性疾病，其發(fā)病機制尚不清楚，近幾年來許多國外學者Arita等［5］研究表明 ITP患者 B1細胞(CD5+B淋巴細胞)水平表達異常，在ITP發(fā)病中所起的作用越來越受到重視，其主要表現(xiàn)為B1細胞水平及PAIgG明顯升高，B1細胞水平及PLT計數(shù)水平呈明顯負相關(guān)，病情緩解后B1細胞水平下降［6－7］。

本研究結(jié)果顯示57例初治ITP患者外周血B1細胞與PLT計數(shù)呈中度負相關(guān)，B1細胞與PAIgG呈中度正相關(guān)，外周血PLT計數(shù)與PAIgG呈中度負相關(guān)。在甲潑尼龍治療有效組，治療后患者外周血B1細胞及PAIgG水平明顯下降，而無效組B1細胞及PAIgG水平未見下降，說明甲潑尼龍治療后，療效較好的患者其外周血B1細胞水平逐漸下降并恢復正常，使免疫狀態(tài)達到新的平衡;而治療無效的患者其B1細胞水平未見下降，說明治療后仍處在免疫功能紊亂狀態(tài)，提示患者B1細胞水平與病情及預后存在一定的相關(guān)性，可作為評估預后及療效的一項參考指標，也可能是判定ITP治療后免疫功能是否恢復正常的一種參考指標;若結(jié)合PAIgG水平及其他的臨床相關(guān)資料，有可能為不同患者進行分層治療提供依據(jù)。當然B1細胞水平與ITP的發(fā)生和療效的關(guān)系，還有待進一步隨機雙盲的大樣本研究驗證。

目前國內(nèi)外研究還顯示ITP發(fā)病與各種病原體感染如病毒、細菌有關(guān)［8－9］，感染后引起人體內(nèi)免疫功能紊亂，從而導致PLT計數(shù)下降。其中H.pylori感染目前被認為是引起ITP的確切的病因之一［4］，其可能機制是H.pylori與血小板某些抗原成分存在交叉性，感染后易被機體免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生 PAIgG［10］，或慢性炎癥使機體細胞因子網(wǎng)絡(luò)發(fā)生變化，產(chǎn)生免疫失耐并激活B淋巴細胞，但H.pylori感染后是否通過激活B1淋巴細胞引起免疫功能紊亂，目前尚不明確。

本研究通過對37例H.pylori感染的難治性血小板減少性紫癜 (RITP)患者治療前后外周血B1淋巴細胞、PLT計數(shù)進行監(jiān)測分析發(fā)現(xiàn)，RITP患者外周血B1細胞的數(shù)量明顯高于正常者，分別為(9.2±4.9)% 和 (2.1±1.2)%，這與國外的研究結(jié)果一致［11－12］，提示B1細胞在ITP發(fā)病過程中有重要的作用。有效抗H.pylori治療后37例RITP外周血B1細胞水平總體上較治療前有所下降， (4.9±3.6)% 和 (9.2±4.9)%，PLT計數(shù)較治療前有所上升，(48±12) ×109/L和(18±9) ×109/L，有效抗 H.pylori治療后，PLT計數(shù)有所上升，而B1細胞水平有所下降，說明抗H.pylori有效治療與B1細胞的變化存在一定的相關(guān)性，換角度說，以上結(jié)論間接提示H.pylori感染引起ITP的發(fā)病可能通過B1細胞途徑而發(fā)揮作用，當然這還有待于進一步的臨床與基礎(chǔ)研究來證實。

本研究對初治ITP患者用激素治療以及難治性ITP患者抗H.pylori感染治療前后B1細胞水平變化進行分析，使我們更清楚地看到B1細胞在ITP發(fā)病中的重要作用，提示ITP患者外周血B1細胞水平與病情及預后存在一定的相關(guān)性。

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