口腔拭子在藥物性耳聾基因檢測中的應用

張瓊敏，鄭靜，宋攀攀，朱翌，陳曉云，管敏鑫

（1.溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035）

位于高度保守的12S rRNA基因解碼區(qū)的同質性A1555G和C1494T突變可導致其攜帶者對氨基糖甙類藥物超敏感[1-4]。開展線粒體DNA A1555G和C1494T突變篩查，可從根本上減少對氨基糖甙類藥物敏感的個體發(fā)生藥物性耳聾。外周血作為基因檢測的主來樣本來源，具有基因含量豐富、存儲方便等優(yōu)點，然而抽血是有侵入性的操作，并且需要相應的人力物力才能完成。如果以血液作為唯一的基因來源勢必會給基因篩查的實驗研究及臨床運用造成諸多不便。那么簡易無損的口腔黏膜拭子是否可以取代血液完成藥物性致聾基因的檢測？其成功率與可靠性如何？本實驗做了深入的研究。

1 材料和方法

1.1 對象及材料 溫州特殊教育學校非綜合征型耳聾學生97例（男57例，女40例，平均年齡13歲）。取被檢者口腔黏膜拭子3根于信封中室溫貯存，并取靜脈血2 mL，EDTA抗凝于冰箱4 ℃貯存。以上工作均按照溫州醫(yī)學院倫理委員會管理規(guī)定，在患者及其家屬成員簽定知情同意書下完成。

1.2 試劑與器材 細胞裂解液（10 mmol/L Tris·HCl、1 mmol/L EDTA、0.1% SDS）、蛋白酶K、冰醋酸鉀（3 mol/L KAC、5 mmol/L CH3COOH）、異丙醇、75%酒精，QIAamp DNA Mini Kit（50）（德國QIAGEN生物公司），Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（大連寶生物工程有限公司），TaKaRa Ex Taq（大連寶生物工程有限公司），DL2，000TMDNA Marker（大連寶生物工程有限公司），Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（大連寶生物工程有限公司），引物合成由大連寶生物工程有限公司完成。MyCycler Thermal Cycler 170-9703 PCR 擴增儀（BIO-RAD公司），DYY-III-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀（北京六一儀器廠），Gene Genius Bio imaging sys-tem紫外凝膠分析系統(tǒng)（SynGene公司），Thermo Scientific nanodrop2000spetrophotometer超微量分光光度計（北京星越生物科技有限公司），所有測序工作均由北京華大基因公司完成。

1.3 方法

1.3.1 口腔拭子的獲?。喝?根普通醫(yī)用消毒棉簽反復刮拭受檢者面頰內壁黏膜6次（受檢者30min內未進食），空氣中干燥后貯存于干凈的信封中室溫保存。

1.3.2 口腔拭子DNA的提?。菏止しǎ河孟竞蟮蔫囎訉L干的口腔拭子表面的硬質棉花撕脫，置于2 mL的EP管中，加入600 mL細胞裂解液及3 mL蛋白酶K混勻，放入55 ℃的恒溫水浴箱中孵育90 min，加入600 mL -20 ℃預冷的冰醋酸鉀，顛倒混勻，冰浴10 min，4 ℃離心（12500 r/min，10 min），將上清液移至裝有600 mL預冷的異丙醇的EP管中并混勻。置于-20 ℃的冰箱中30 min，常溫離心（12500 r/min，20 min），棄去上清液。加入600 mL 75%乙醇，小心吹打混勻，離心（12500 r/min，7 min），棄去上清液，靜置干燥待酒精揮發(fā)至無味時加入20 mL高壓去離子水。

試劑盒法：按QIAampDNA mini Kit（50）試劑盒的說明書要求提取DNA。

1.3.3 靜脈血DNA的提取：按TAKERA DNA EXTRACTION KIT試劑盒說明書提取。

1.3.4 口腔拭子及靜脈血DNA濃度及純度的測定：用超微量分光光度計測定DNA溶液的A260值及A260/A280值來衡量DNA的濃度及純度。

1.3.5 基因擴增：使用Primer 5.0軟件和Oligo7.0軟件根據(jù)人類線粒體基因序列（GenBank登錄號：AC_000021）設計引物Mit-2F、Mit-2R。上游引物5’-CGA TCA ACC TCA CCA CCT CT-3’，下游引物5’-TGG ACA ACC AGC TAT CAC CA-3’，引物由大連寶生物公司合成。Mit-2F、Mit-2R用于擴增包含A1555A及C1494C野生型位點的線粒體基因。在25 mL反應體積中，取口腔黏膜拭子或全血的樣品DNA 25 mL，10 mmol/L引物正反向各0.2 mL，0.2 mmol/L d-NTP 2 mL，10×PCR緩沖液2 mL，25μmol/L MgCl21.5 mL，5 U/mL Taq酶0.1 mL，ddH2O 18 mL。PCR儀上94 ℃ 5 min熱變性后，94 ℃ 30 s→55 ℃30 s→72 ℃ 30 s，循環(huán)35次，72 ℃延長10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.3.6 測序及數(shù)據(jù)分析：口腔拭子及靜脈血DNA的PCR產物送上海華大基因公司直接測序，測序結果使用Gentle軟件與人類線粒體標準序列校正后的人類線粒體DNA劍橋參考序列（Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence，Last updated 2008-2-16）進行比對，發(fā)現(xiàn)A1555G及C1494T的突變后用Chromas 2.0軟件讀取測序結果的峰圖文件，進行確認或排除。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 3組DNA濃度及純度數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析、LSD-t檢驗及卡方檢驗。

2 結果

2.1 DNA濃度及純度 采用手工法提取的口腔拭子DNA量與使用試劑盒法差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。而手工法提取的DNA純度指標A260/A280低于使用試劑盒法，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。試劑盒法與手工法提取的基因組DNA的PCR成功率與外周血差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 不同樣本來源的DNA濃度、純度及PCR成功率

2.2 口腔拭子及靜脈血DNA PCR產物的電泳條帶比較 靜脈血及口腔拭子的擴增產物均停留在802 bp附近，且擴增效果一致，結果見圖1。

圖1 PCR擴增產物電泳圖

2.3 口腔拭子及靜脈血DNA PCR產物送測結果及峰圖 口腔拭子DNA的PCR產物完全符合測序對模板的要求，97例均可得出測序結果峰圖。兩組樣本的測序結果相一致，均顯示A1555G突變陽性2例，陰性95例。C1494T突變97例均為陰性。

口腔拭子DNA擴增產物的測序峰如圖2。圖2A顯示的是靜脈血DNA擴增產物測定為A1555G突變陽性的耳聾患者的口腔拭子的實驗結果，圖2B顯示的是A1555G突變陰性的耳聾患者的口腔拭子的實驗結果，圖2C顯示的是C1494T突變陽性耳聾患者的測序峰圖（本研究試驗結果中無陽性結果，僅作對比參考），圖2D顯示的是C1494T突變陰性的耳聾患者的口腔拭子的實驗結果。

圖2 PCR產物擴增的結果判定圖

3 討論

近年來，基因檢測技術發(fā)展頗為迅速，而在樣本取材（DNA來源）上卻鮮有突破性的進展。血液中的病原體有潛在的致病風險。抽血給許多被檢者尤其是嬰幼兒帶來了一些痛苦和傷害，而且在跨地區(qū)傳遞樣本時也存在一定的麻煩。此外抽血的高成本費用成為基因檢測普及的制約因素[5]。目前，國內尚無報道采用血液以外的其他樣本作為致聾基因檢測的DNA來源的研究。因此，迫切需要一種簡便無損的基因獲取方法以滿足對耳聾基因突變進行檢測乃至廣泛篩查的需要。國內外科研力量也在提取DNA方面不斷的嘗試尋求可以取代血液的其他生物檢材，如采用脫落的口腔黏膜上皮、毛囊、精液等各種可能含有DNA的人體檢材[6-7]。在口腔黏膜上皮的收集方式上，文獻[8]報道過口腔細胞刷、口腔黏膜拭子、牙簽、漱口等多種方式。其中漱口法的DNA產量是相對最高的[9]，但是樣本的處理卻相對麻煩[10]。口腔黏膜拭子取材及樣本處理過程都更為簡易，故本研究采集患者的口腔黏膜拭子，通過簡單又相對無毒性的細胞裂解法及試劑盒法提取DNA進行PCR反應并測序。

口腔拭子是否可以取代血液成為DNA來源，關鍵在于其樣本的儲存穩(wěn)定性及可提取的DNA的量和純度是否滿足PCR的要求。相關研究已表明風干后的口腔黏膜上皮標本在室溫儲藏條件下2周內會一直保持穩(wěn)定的狀態(tài)[10]。并且樣本DNA的產量與一定期限內的儲存時間并不存在明顯的相關性[1-4]。分析本研究結果，可發(fā)現(xiàn)口腔拭子中提取的DNA的PCR成功率與血液DNA差異無統(tǒng)計學意義，且兩種方法提取的DNA基本都可以滿足藥物性致聾基因的擴增。其中失敗的手工法2例及試劑盒法3例的DNA濃度均小于10 ng/mL，可能是濃度過低引起PCR的失敗。從表1也可以看出單根口腔拭子提取的DNA產量波動性是較大的，這是由單根拭子口腔上皮細胞的采集不可量化而造成的結果?？梢酝ㄟ^同時提取數(shù)根口腔拭子DNA來避免波動性過大引起的產量過低的問題。DNA獲得成功擴增的口腔拭子的測序結果與相應的血液的結果完全符合，說明采用口腔拭子進行基因檢測結果是完全可靠的。另外，通過對兩種口腔黏膜拭子DNA提取方法的比較發(fā)現(xiàn)，試劑盒法所提取的DNA純度較手工法高，但是價格昂貴，平均每根口腔拭子成本為30元人民幣，而手工法每根成本僅為3元人民幣。從利于藥物性耳聾基因檢測的普遍開展的角度出發(fā)，手工法提取口腔拭子DNA更適宜。

本項對比研究結果表明口腔黏膜拭子據(jù)有操作簡單、價格低廉的優(yōu)勢，可以代替靜脈血成為基因組DNA的另一來源途徑，并可以其無損傷性應用于新生兒、精神病人及不愿意提供血液人群的藥物性耳聾基因的檢測，具有較高的臨床應用價值。

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