激光共聚焦顯微重建鮮紅斑痣三維結(jié)構(gòu)的初步研究

田克斌，韓麗林，江銀華，周國瑜

（1.麗水市人民醫(yī)院 口腔科，浙江 麗水 323000；2.上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院 口腔頜面外科，上海 200011）

光動(dòng)力治療和脈沖激光治療鮮紅斑痣要取得好的效果[1-2]，必須對病灶的結(jié)構(gòu)有清楚的了解，才能對治療參數(shù)，比如能量、脈寬等做出相應(yīng)的選擇，達(dá)到理論上實(shí)現(xiàn)對血管的選擇性破壞，周圍正常組織得到保護(hù)。已有文獻(xiàn)報(bào)道組織鑄型、連續(xù)切片等技術(shù)進(jìn)行組織的三維結(jié)構(gòu)重建[3-4]，但鮮紅斑痣常常不是由固定知名血管供血，使組織鑄型技術(shù)難于實(shí)際應(yīng)用，而連續(xù)切片耗時(shí)又浪費(fèi)大量勞力，故也難以廣泛應(yīng)用。本研究通過厚切片、免疫熒光染色、利用“顯微CT”[5]激光共聚焦顯微鏡觀察，得到鮮紅斑痣三維結(jié)構(gòu)分布圖像。

1 材料和方法

1.1 材料 選取我科臨床、病理診斷為鮮紅斑痣病1例的石蠟包塊作標(biāo)本，共5個(gè)石蠟塊?；颊吣行?，44歲，標(biāo)本切取部位為面部，未經(jīng)過治療，皮損形態(tài)突出皮膚表面，暗紅色，病灶壓迫可褪色（見圖1）。主要儀器：LSM 510 ZEISS 上海第二醫(yī)科大學(xué)激光共焦室。主要試劑：鼠抗人anti-cd34（CHEMICON公司），羊抗鼠FITC標(biāo)記二抗（長島公司）。

圖1 患者標(biāo)本切取部位（面部）

1.2 方法

1.2.1 載玻片的處理：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5 min，室溫過夜干燥，裝盒備用。

1.2.2 厚切片的制備：30μm、10μm厚切片，同時(shí)制備4μm切片以便于對比。5個(gè)石蠟塊的切片數(shù)目見表1。

表1 每個(gè)石蠟塊切片的詳細(xì)數(shù)目

1.2.3 染色：分別予HE常規(guī)染色、免疫組化染色、免疫熒光染色，以CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，以便觀察小血管及與周圍組織對照。陽性對照：已知為CD34陽性的鮮紅斑痣標(biāo)本；陰性對照：正常皮膚組織；空白對照：以PBS液取代。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡重建：通過激光共聚焦顯微鏡觀察切片，進(jìn)行三維重建[5]：激光共聚焦顯微鏡能以一定厚度的層距沿軸向?qū)M織進(jìn)行分層掃描，得到一系列連續(xù)的光學(xué)切片，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換后作為二維數(shù)組儲(chǔ)存，逐層掃描得到的二維數(shù)組通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行不同的三維重建算法，作單色圖像處理，組合成真實(shí)的三維結(jié)構(gòu)圖形。

2 結(jié)果

除了4μm切片都完成全部染色過程外，10μm及30μm的切片很難完成全部染色，因?yàn)樵诿庖邿晒馊旧倪^程中，特別是抗原修復(fù)時(shí)，厚切片容易出現(xiàn)掉片，最后染色結(jié)果見表2。

表2 5例標(biāo)本的免疫熒光染色結(jié)果

4μm的15片切片三種染色都能很好的完成；10μm的切片共25片，完成免疫熒光染色后17片脫片，都發(fā)生在抗原修復(fù)這一步，僅有8片染色成功；30μm切片共50片，它在染色的任何一步都有可能脫片，包括從開始脫蠟至水到后面漂洗過程，完成全部染色過程僅有3片。

4μm和10μm切片經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞很好地被特異性染色，周圍組織非特異性的熒光很少見，經(jīng)逐層掃描三維重建后（見圖2），有完整的血管形態(tài)及很少量的立體分布信息。因組織量少，包含的血管空間體積少，三維重建后圖像也比較小。

圖2 三維重建后的圖形

30μm切片經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞沒有很好地被特異性染色，周圍組織非特異性的熒光多見，經(jīng)逐層掃描三維重建后，雖然也有完整的血管形態(tài)，但與周圍組織不能很好地區(qū)別，因組織量大，可顯示較多血管立體分布信息。旋轉(zhuǎn)不同角度可觀察各側(cè)面的表面形態(tài)，也可不同的斷面觀察組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測量血管管徑、斷層面積和體積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。通過摸擬熒光處理算法，可以產(chǎn)生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體感，也可通過角度旋轉(zhuǎn)和位置變化產(chǎn)生三維動(dòng)畫效果。

3 討論

由于病變血管直徑存在差別，激光儀器治療參數(shù)應(yīng)該是可調(diào)節(jié)的，但是早期激光儀器的脈沖、脈寬多為固定不變的，使得這類激光儀器很快被可以根據(jù)不同病變來調(diào)整脈寬大小的激光儀器[6]取代。為了精確地估計(jì)目標(biāo)組織，臨床工作者感到三維結(jié)構(gòu)重建的必要性。因?yàn)槿S圖形更接近組織的自然狀態(tài)，可直觀地觀察結(jié)構(gòu)的分布，便于研究鄰近結(jié)構(gòu)的位置關(guān)系。激光共聚焦顯微鏡在三維結(jié)構(gòu)重建[5，7]中，對組織逐點(diǎn)掃描，經(jīng)空間濾波后，有效抑制干擾熒光，光源為單色性好的激光，基本消色差，成像聚焦后焦深小，可無損傷地對樣品作不同深度的層掃描。沒有組織切片二維圖像的全貌顯示、切片層間配準(zhǔn)、切片變形、各個(gè)切片間均勻數(shù)字化采集等問題[4]。激光共聚焦顯微鏡能以一定厚度的層距沿軸向?qū)M織進(jìn)行分層掃描，得到一系列連續(xù)的光學(xué)切片，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換后作為二維數(shù)組儲(chǔ)存。它在鮮紅斑痣三維結(jié)構(gòu)重建中的成功應(yīng)用，使其成為一種簡單易行的方法。

厚切片免疫熒光染色過程存在兩個(gè)難點(diǎn)：①厚切片的制備：為了更好的重建鮮紅斑痣的三維結(jié)構(gòu)，要求組織有一定的厚度，但受切片技術(shù)、免疫熒光染色過程及激光穿透深度的限制。綜合多方面因素考慮后，我們選定30μm厚切片作我們擬重建的組織厚度，相對常規(guī)組織切片的厚度4～6μm來說，雖然只差二十幾微米，制作難度有很大差別。與常規(guī)組織切片相比，切片時(shí)石蠟塊易出現(xiàn)破碎分裂、包埋組織與石蠟分離，很難切出包含完整組織的切片。在我們實(shí)驗(yàn)中，在切片前采用具有一定黏性的紙貼在將要切的組織面，起保護(hù)作用防止碎裂，切下組織片后在45 ℃溫水中取下保護(hù)紙片，這樣就完成厚切片的制備。②抗原修復(fù)的問題：30μm厚切片與10μm厚切片在抗原修復(fù)容易發(fā)生脫片，因使用的抗體要求用熱修復(fù)抗原，當(dāng)溫度升高后原有的黏接物質(zhì)被破壞，組織塊與玻片之間分離，在漂洗時(shí)就出現(xiàn)脫片。為了防止脫片，進(jìn)一步的研究是有必要的，其他的染色方法比如使用酶消化修復(fù)抗原的抗體，來防止脫片現(xiàn)象。

活體診斷研究的激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用[8]使臨床醫(yī)生對人體鮮紅斑痣三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察成為可能，但是這項(xiàng)技術(shù)要在臨床常規(guī)應(yīng)用尚面臨以下問題：①可視深度。②圖像質(zhì)量需進(jìn)一步改善，為改善圖像質(zhì)量就有可能利用激光共聚焦顯微鏡重建的三維圖形。③活體的激光共聚焦顯微鏡無法獲得縱剖面的信息，因活體診斷研究的激光共聚焦顯微鏡的圖像質(zhì)量需要進(jìn)一步改善，才有可能為臨床提供有輔助價(jià)值的圖像。我們利用組織石蠟切片的方法重建鮮紅斑痣三維結(jié)構(gòu)，可得到比較清晰的圖片。如要達(dá)到既能在活體應(yīng)用又能得到清晰圖片的目標(biāo)，一種可能的方法就是，先利用組織石蠟切片的方法重建大量鮮紅斑痣標(biāo)本的三維結(jié)構(gòu)，同時(shí)用在活體研究的激光共聚焦顯微鏡記錄粗略圖形，然后把二者聯(lián)系起來，建立數(shù)據(jù)庫。臨床遇到相應(yīng)病例時(shí)就可依據(jù)數(shù)據(jù)庫來選擇治療參數(shù)，從而對臨床治療效果和預(yù)后判斷產(chǎn)生積極作用。

[1] 周國瑜,張志愿,張陳平,等.口腔頜面部靜脈畸形及血管瘤的激光治療研究[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2005,40(3):200-202.

[2] 張志愿,周國瑜. 頜面部血管瘤及血管畸形分類選擇綜合治療研究進(jìn)展[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2002,34(2):99-102.

[3] Smithies DJ, van Gemert MJ, Hansen MK, et al. Threedimensional reconstruction of port wine stain vascular anatomy from serial histological sections[J].Phys Med Biol,1997,42(9):1843-1847.

[4] 馬慧軍, 趙廣,孟如松,等. 色素痣三維結(jié)構(gòu)的實(shí)現(xiàn)與研究[J].CT理論與應(yīng)用研究,2002,11(1):26-29.

[5] 細(xì)胞生物學(xué)教研室.細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)[M].上海:上海第二醫(yī)科大學(xué)出版社,2003:24-29.

[6] Astner S, Anderson RR. Treating vascular lesions[J].Dermatol Ther,2005,18(3):267-281.

[7] Zhang WH, Zhu SN, Lu SL, et al. Three-dimensional image of hepatocellular carcinoma under confocal laser scanning microscope[J]. World J Gastroenterol,2000,6(3):344-347.

[8] 田克斌,周國瑜. 激光掃描共焦顯微鏡活體組織診斷技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展[J].上?？谇会t(yī)學(xué),2006,15(1):97-100.