細(xì)粒棘球絳蟲Eg95抗原表位的生物信息學(xué)預(yù)測＊

李玉嬌，王 晶，趙 慧，賈海英，李 博，馬秀敏，溫 浩，丁劍冰，

2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830000；

3.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊 830000；

4.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011

細(xì)粒棘球絳蟲Eg95抗原表位的生物信息學(xué)預(yù)測＊

李玉嬌1，王 晶2，趙 慧1，賈海英3，李 博2，馬秀敏4，溫 浩1，丁劍冰1，4

目的 應(yīng)用軟件和在線網(wǎng)絡(luò)分析Eg95的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，為確定和篩選優(yōu)勢表位，研制安全、高效的表位疫苗奠定基礎(chǔ)。方法 采用DNAStar軟件和在線網(wǎng)站IEDB、SYFPEITHI等對(duì)Eg95的B細(xì)胞表位和 T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果 Eg95存在潛在的抗原表位，B細(xì)胞表位區(qū)域：16－38，41－48，50－67，68－90，92－100，103－113，120－132。分值高的 T細(xì)胞表位區(qū)域：6－14，14－22，48－56，4－12，98－106，142－150，146－154。結(jié)論 運(yùn)用生物信息學(xué)方法確定Eg95存在7個(gè)抗原表位，對(duì)進(jìn)一步研究Eg95的抗原性和研發(fā)優(yōu)勢表位疫苗具有重要的意義。

Eg95；抗原表位；生物信息學(xué)

2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830000；

3.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊 830000；

4.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011

細(xì)粒棘球蚴?。╡chinococcosis）又稱囊型包蟲?。╟ystic echinococcosis，CE），是由細(xì)粒棘球絳蟲（Echinococcusgranulosus，Eg）幼蟲引起的一種人獸共患慢性寄生蟲病，呈全球性分布。我國是細(xì)粒棘球蚴病發(fā)病最高的國家之一，至今已在25個(gè)省、市、自治區(qū)發(fā)現(xiàn)有人、畜原發(fā)性棘球蚴病，主要流行在西部的新疆、青海、甘肅、寧夏等牧區(qū)和半牧區(qū)［1］。經(jīng)過流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，2004－2008年總體上報(bào)告包蟲病病例數(shù)呈增加趨勢［2］。目前對(duì)于包蟲病的治療主要以手術(shù)治療為主，藥物治療為輔，效果欠佳。采用給犬定期驅(qū)蟲和宣傳教育為主的綜合性防治措施的效果也不理想，因此人們一直在研究更有效的防治措施。免疫預(yù)防是防止包蟲病流行比較理想的途徑。采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲的有效免疫原成分進(jìn)行篩選和克隆，制備基因工程疫苗，為包蟲病的免疫預(yù)防和免疫診斷開辟了新途徑［3］。Lightowlers等［4］發(fā)現(xiàn)Eg95重組蛋白疫苗免疫中間宿主（羊），可抵抗六鉤蚴的感染獲得95%～100%的免疫保護(hù)作用，其中86%得到完全保護(hù)，認(rèn)為Eg95是較理想的保護(hù)性抗原。賈海英等［5］將Eg95與pET28a重組融合構(gòu)建了pET28a－Eg95重組質(zhì)粒，經(jīng)過Western blot實(shí)驗(yàn)，其中11例陽性患者的血清中有8份都與pET28a－Eg95重組蛋白有陽性反應(yīng)，其中5份正常人的血清不與其發(fā)生陽性反應(yīng)，該結(jié)果表明Eg95抗原在CE病人體內(nèi)有較高免疫原性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，表位疫苗［6］（Epitope vaccine）成為分子疫苗的研究熱點(diǎn)，它是根據(jù)抗原表位氨基酸序列制備而成的疫苗，包括合成肽疫苗［7］（synthetic peptide vaccine）、重組表位疫苗［8］（Recombinant epitope－based vaccine）及表位 核 酸 疫 苗［9］（Epitope DNA vaccine，minigenes/epigenes）等形式，是目前研制抗感染性疾病、惡性腫瘤、寄生蟲病疫苗的發(fā)展方向，研制表位疫苗面臨的最大挑戰(zhàn)就是如何找到抗原上免疫原性最強(qiáng)的區(qū)域，即表位所在的位置［10］。Eg95分子是一種分子量為24.5kDa的天然六鉤蚴抗原，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行Eg95的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位預(yù)測，為包蟲病診斷和表位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1Eg95氨基酸序列 根據(jù)GenBank的Eg95基因序列，經(jīng)過多重序列比對(duì)，確定最終進(jìn)行分析的Eg95基因序列（GenBank登錄號(hào)：HM345607），長471bp，用DNAMAN軟件推導(dǎo)出Eg95抗原氨基酸序列，它編碼156個(gè)氨基酸殘基：MAFQLCLILFATSVLAQEYKGVGKGQGQQETPLRNHFNL TPVGSQGIRLSWEVQHLSDLKGTDISLRAVN PSDPLVCKRQTAKFSDGQLAVGELKPSTLYK MTVEAVKAKKTILGFTVDIETPRAGKKEST VMTSGSALTSAIAGFVFSCIVVVLT

1.1.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件TMHMM Sever2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM）分析Eg95抗原的跨膜序列，SOPMA Sever（http：//npsa－pbil.ibcp.fr/cgi－bin/npsa＿automat.pl？page＝/NPSA/npsa＿sopma.html）預(yù)測Eg95的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.1.3 抗原表位預(yù)測軟件 B細(xì)胞表位：DNAStar軟件及在線預(yù)測軟件IEDB （http：//tools.immuneepitope.org/main/index.html）。T 細(xì)胞表位：（SYFPEITHI http：//www.syfpeithi.de）和（BIMAS http：//bimas.dcrt.nih.gov/ molbio/hla＿bind/）。

1.2 方法

1.2.1 采用DNAStar軟件的Protean程序以及在線預(yù)測網(wǎng)站IEDB （http：//tools.immuneepitope.org/main/index.html）結(jié)合親水性參數(shù)、可及性參數(shù)、抗原性指數(shù)、柔韌性參數(shù)及二級(jí)結(jié)構(gòu)方案對(duì)Eg95抗原的B細(xì)胞表位進(jìn)行綜合預(yù)測。

1.2.2 通過在線網(wǎng)絡(luò)資源的使用在以下兩個(gè)網(wǎng)站：（SYFPEITHI http：//www.syfpeithi.de）和（BIMAS http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla＿bind/）通過其各種算法對(duì)Eg95抗原的T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié) 果

2.1 B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果

2.1.1 Eg95跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測 用 TMHMM 對(duì)Eg95的跨膜序列進(jìn)行分析，Eg95的跨膜區(qū)在133－155位區(qū)域，其中1－132位區(qū)域顯示為膜外區(qū)，156為膜內(nèi)區(qū)（見圖1）。

圖1 TMHMM分析的Eg95跨膜結(jié)構(gòu)Fig.1 Transmembrane struture of Eg95using TMHMM analysis

2.1.2Eg95抗原蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA Sever對(duì)Eg95的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Eg95基因中柔性結(jié)構(gòu)占氨基酸總數(shù)的43.59%，其中無規(guī)則卷曲占40.38%，β轉(zhuǎn)角為3.21%。α螺旋和β折疊分別占到32.05%和24.36%，各種結(jié)構(gòu)在Eg95抗原中的分布情況見圖2。

圖2 SOPMA分析的Eg95二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure of Eg95using SOPMA analysis

2.1.3 用DNAStar軟件對(duì)Eg95B細(xì)胞表位預(yù)測DNAStar軟件對(duì)Eg95的預(yù)測結(jié)合了以下有代表性的參數(shù)綜合預(yù)測方案（見圖3）：1）以 Hopp和Woods方案預(yù)測的Eg95親水性區(qū)域?yàn)椋?5－40，47－65，69－87，96－101，120－134。2）用Emini蛋白可及性方案分析，分值比較高的區(qū)域?yàn)椋?4－37，79－86，94－111，121－131。3）經(jīng)過 Karplus－Sohulz柔性區(qū)域的分析，Eg95可塑性較強(qiáng)的區(qū)域?yàn)椋?8－35，40－48，57－65，70－75，78－88，93－99，108－112，120－139。4）采用Jameson－Wolf方法對(duì)Eg95的抗原性指數(shù)進(jìn)行預(yù)測，抗原性指數(shù)較高的表位區(qū)域?yàn)椋?7－38，41－48，55－67，68－90，92－99，103－113，120－133，136－138。聯(lián)合以上的參數(shù)和Eg95的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合分析，得出Eg95有7個(gè)潛在的的B細(xì)胞抗原表位，分別為：17－38，41－48，57－67，68－90，92－99，104－113，120－133。

圖3 DNAStar分析Eg95的各項(xiàng)參數(shù)Fig.3 The parameters of Eg95using DNAStar analysis

2.1.4 在線網(wǎng)絡(luò)IEDB預(yù)測Eg95抗原B細(xì)胞表位 通過在線網(wǎng)絡(luò)IEDB對(duì)Eg95進(jìn)行表位預(yù)測（見圖4）：1）Chou＆ Fasmanβ轉(zhuǎn)角的預(yù)測，分值較高的區(qū)域?yàn)椋?9－49，56－65，68－78，82－91，93－100，121－140。2）對(duì)Eg95進(jìn)行Emini表面可及性的分析，分值較高的區(qū)域?yàn)椋?6－22，23－37，68－73，78－88，92－103，107－111，120－130。3）在Karplus ＆Schulz柔韌性區(qū)域的預(yù)測中，Eg95分值高的區(qū)域?yàn)椋?8－37，40－47，57－65，70－75，78－89，92－100，109－113，120－139。4）通過Kolaskar ＆Tongaonkar抗原性指數(shù)預(yù)測，可能存在的表位區(qū)域?yàn)椋?－22，39－48，50－59，65－80，86－94，101－121。5）Parker的親水性預(yù)測顯示Eg95的高親水性區(qū)域?yàn)椋?6－34，40－47，55－65，68－76，78－90，103－112，119－140。6）通過 Bepipred預(yù)測抗原表位，Eg95存在多個(gè)Bepipred線性抗原表位區(qū)域?yàn)椋?9－33，41－44，69－76，82－86，120－134。綜合以上參數(shù)分析，得出Eg95的潛在抗原表位區(qū)域也為 7個(gè)，分別是：16－37，41－47，50－65，68－90，92－100，103－112，120－139。

通過綜合以上兩個(gè)分析軟件的結(jié)果，將兩個(gè)軟件預(yù)測為表位的相同區(qū)域確定為最終Eg95的B細(xì)胞抗原表位區(qū)域，分別為：16－38，41－48，50－67，68－90，92－100，103－113，120－132。

2.2 T細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果

2.2.1 SYFPEITHI預(yù)測Eg95抗原T細(xì)胞表位

在進(jìn)行T細(xì)胞表位的預(yù)測后，選取了分值高的13個(gè)T細(xì)胞抗原表位，預(yù)測的結(jié)果見表1。

2.2.2 在線網(wǎng)絡(luò)預(yù)測Eg95抗原T細(xì)胞表位 為了提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，同時(shí)用在線預(yù)測工具（http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla＿bind/）對(duì)Eg95的T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見表2。

綜合兩個(gè)在線軟件的預(yù)測，確定了在兩種方法中分值都比較高的七個(gè)表位為Eg95的T細(xì)胞表位區(qū)域，分別是：6－14，14－22，48－56，4－12，98－106，142－150，146－154。

3 討 論

圖4 IEDB分析的Eg95的B細(xì)胞抗原表位Fig.4 The parameters of Eg95using IEDB analysis

表1 SYFPEITHI預(yù)測的MHCⅠ類HLAA 0201限制性T細(xì)胞表位Table 1 HLA－A＊0201nonamers T cell epitope using SYFPEITHI

寄生蟲病仍是發(fā)展中國家亟待解決的公共衛(wèi)生問題，研制抗寄生蟲病疫苗是人們關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。包蟲病嚴(yán)重影響我國西部牧區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民的身體健康，而且新的感染和發(fā)生區(qū)域也在不斷擴(kuò)大，因此通過免疫預(yù)防途徑控制和消滅包蟲病將是行之有效的方法。20世紀(jì)80年代Strohmaier［11］等發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒（FMDV）的 146－154及200－213氨基酸肽段含有免疫性位點(diǎn)，從而找到了一種新型的疫苗，即表位疫苗。表位（epitope）是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱抗原決定簇（antigenic determinant），它是T細(xì)胞抗原受體（Tcell receptor，TCR）和B細(xì)胞抗原受體（B cell receptor，BCR）及抗體特異性結(jié)合的基本單位，分為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。

表2 在線網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的MHCⅠ類HLAA 0201限制性T細(xì)胞表位Table 2 HLA－A＊0201nonamers T cell epitope using Internet

分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究快速向前發(fā)展，如何利用細(xì)胞表位預(yù)測新方法，高效快速地獲得表位的信息，已經(jīng)成為抗包蟲病疫苗研究中的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的篩選方法，包括噬菌體肽庫，核磁共振技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)，SPR等多種手段都需要做大量的工作，花費(fèi)大量的經(jīng)費(fèi)，但是預(yù)測的準(zhǔn)確性卻有限，這讓人們感到困擾。隨著計(jì)算機(jī)知識(shí)的普及和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展，預(yù)測表位的參數(shù)計(jì)算變得容易操作。以往表位預(yù)測多采用單參數(shù)預(yù)測，有其局限性，隨著生物信息網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展和數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)展，多參數(shù)多方法的綜合預(yù)測已成為當(dāng)前表位預(yù)測的主流，可顯著提高預(yù)測的準(zhǔn)確性［12］。李晉濤［13］運(yùn)用多種方法對(duì)Eppin的二級(jí)結(jié)構(gòu)和表面特性，如親水性、理化性質(zhì)、可及性、免疫原性和可塑性等方面進(jìn)行分析，得出其存在多個(gè)潛在的抗原表位。經(jīng)過體外實(shí)驗(yàn)證明，所預(yù)測抗原表位區(qū)域基本能與免疫抗血清發(fā)生抗原特異性反應(yīng)。李章球［14］應(yīng)用SYFPEITHI等7種軟件對(duì)人、鼠源血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa抗體蛋白進(jìn)行 HLA－A＊0201、HLA－A＊1101和 HLA－A＊2401限制性表位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了GPⅡb/Ⅲa抗體蛋白的T細(xì)胞表位。

本研究利用生物信息網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對(duì)Eg95抗原的B細(xì)胞表位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其跨膜結(jié)構(gòu)中有一個(gè)跨膜區(qū)，一般比較穩(wěn)定，不容易發(fā)生氨基酸的變異和表位形成?？乖娜嵝詤^(qū)域主要集中在膜外區(qū)，本研究氨基酸序列也證實(shí)了這一結(jié)果。用TMHMM對(duì)Eg95抗原的跨膜序列進(jìn)行分析，膜外區(qū)占了大部分的區(qū)域，說明這些區(qū)域產(chǎn)生抗原表位的可能性也比較大。用SOPMA Sever進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Eg95氨基酸序列中柔性結(jié)構(gòu)占氨基酸總數(shù)的43.59%，1－132區(qū)域是抗原表位富集的區(qū)域，表明Eg95的抗原表位也集中在該區(qū)域內(nèi)。

在二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測中，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方案認(rèn)為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析與蛋白質(zhì)表位的分布關(guān)系密切，無規(guī)則卷曲和β轉(zhuǎn)角主要位于蛋白質(zhì)的表面，結(jié)構(gòu)突出，有利于與抗體嵌合，成為抗原表位的可能性也較大［15］。本研究用SOPMA Sever對(duì)Eg95進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其無規(guī)則卷曲占40.38%，β轉(zhuǎn)角為3.21%，表明在Eg95的這些區(qū)域中，抗原表位將容易產(chǎn)生并發(fā)揮特異性反應(yīng)。

用抗原表位預(yù)測的經(jīng)典方案對(duì)Eg95進(jìn)行多參數(shù)的預(yù)測，（1）Hopp和 Woods為代表的蛋白質(zhì)的親水性方案（hydrophilicity），此方案認(rèn)為蛋白質(zhì)抗原各氨基酸殘基可分為親水殘基和疏水殘基兩類。在機(jī)體內(nèi)，疏水性殘基一般埋在蛋白內(nèi)部，而親水性殘基位于表面，因此蛋白的親水部位與蛋白抗原表位有密切的聯(lián)系［16］。（2）Emini蛋白可及性方案（accessibility），指蛋白質(zhì)抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性，它反映了蛋白質(zhì)抗原內(nèi)、外各層殘基的分布情況［17］。（3）Karplus－Sohulz柔性區(qū)域預(yù)測方案（flexibility）認(rèn)為蛋白抗原構(gòu)象不是剛性不變的，其多肽鏈骨架有一定程度的活動(dòng)性，也就是蛋白質(zhì)的柔性區(qū)域。活動(dòng)性強(qiáng)的氨基酸殘基即可塑性大的位點(diǎn)，易形成抗原表位［18］。（4）Jameson－Wolf的抗原性指數(shù)方案（Antigenic index）通過對(duì)20個(gè)已研究得很透的蛋白質(zhì)的69個(gè)連續(xù)位點(diǎn)的606個(gè)氨基酸統(tǒng)計(jì)分析，用各氨基酸殘基在已知B細(xì)胞表位中出現(xiàn)的百分率與其通常在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的百分率比值的對(duì)數(shù)建立了抗原性刻度，并以此計(jì)算蛋白中各亞序列的抗原性［19］。（5）β轉(zhuǎn)角的預(yù)測方案認(rèn)為β轉(zhuǎn)角是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類型之一，由4個(gè)氨基酸殘基組成，其中第一個(gè)殘基的CO基團(tuán)和第四個(gè)殘基的NH基團(tuán)之間形成氫鍵，使多肽鏈的方向發(fā)生U形改變。正因?yàn)檫@樣的改變，使表位容易在β轉(zhuǎn)角存在的區(qū)域形成。這些方案的綜合運(yùn)用，將會(huì)提高B細(xì)胞表位預(yù)測的準(zhǔn)確性。

在T細(xì)胞的預(yù)測中，MHCI類抗原表位預(yù)測的準(zhǔn)確率較高，可達(dá)90%左右，MHCI類表位是由9個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的短肽，漢族人種最常見的是HLAA 0201限制的抗原表位［20］。因此本研究對(duì)Eg95進(jìn)行了HLAA 0201MHCI類9肽限制性表位預(yù)測。研究者們發(fā)現(xiàn)根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸的分布，運(yùn)用各種軟件對(duì)氨基酸的構(gòu)成和分布進(jìn)行計(jì)算得出一個(gè)T細(xì)胞表位分值，以表格的形式顯示［21］。本研究將兩種預(yù)測法分值排在前13位的表位進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)兩種不同方法的結(jié)果有許多重復(fù)之處，說明綜合兩種方法的結(jié)果能夠提高預(yù)測方法的準(zhǔn)確性。聯(lián)合各參數(shù)預(yù)測Eg95含有7個(gè)潛在的B細(xì)胞表位分別是16－38，41－48，50－67，68－90，92－100，103－113，120－132，7個(gè)分值較高的 T細(xì)胞表位是6－14，14－22，48－56，4－12，98－106，142－150，146－154。

本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測的這些表位區(qū)域有利于下一步研究和篩選Eg95抗原B細(xì)胞和T細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位，構(gòu)建優(yōu)勢抗原表位疫苗，為獲得高效的保護(hù)性疫苗和預(yù)防包蟲病的流行奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Bioinformatics prediction onEg95antigen epitopes ofEchinococcusgranulosus

LI Yu－jiao，WANG Jing，ZHAO Hui，JIA Hai－ying，LI Bo，MA Xiu－min，WEN Hao，DING Jian－bing

（MedicalResearchCenterandXinjiangKeyFirst，F(xiàn)irstAffiliatedHospital ofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China）

The protein secondary structure was analyzed by TMHMM Sever2.0and SOPMA Sever，and B cell and T cell epitopes ofEg95were predicted by DNAStar，IEDB and SYFPEITHI.Many distinct antigenic epitopes ofEg95were identified by computation，and the possible B cell epitopes of which were in the regions of 16－38，41－48，50－67，68－90，92－100，103－113，and 120－132.The high score of T cell epitopes were in the regions of 6－14，14－22，48－56，4－12，98－106，142－150，and 146－154.These results indicated that there are 7antigen epitopes inEg95antigen determined by bioinformatics methods，which are significant in the further research ofEg95antigenic and development of dominant epitope vaccine.

Eg95；antigen epitope；bioinformatics

R383.3

A

1002－2694（2011）10－0892－05

＊國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （30901374，81060135，30560146，30860263）資助

丁劍冰，Email：djbing002＠163.com

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院新疆重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011；

2010－11－17；

2011－03－23