PEG－6000脅迫下10個苜蓿品種幼苗期抗旱性比較

穆懷彬，伏兵哲，德 英

（1．中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010；2．寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川750021）

苜蓿（Medicago sativa）富含蛋白質，有廣泛的生態(tài)適應性和穩(wěn)定的生產(chǎn)力，適口性好，是世界上栽培面積最廣、最主要的優(yōu)良豆科牧草之一，被人們譽為“牧草之王”。據(jù)文獻資料［1］記載，苜蓿的起源中心是伊朗，之后逐漸傳入其他國家，在中國已有2 000多年的栽培歷史。目前，全世界種植苜蓿已達3 330萬hm2。我國中西部和北方地區(qū)的中溫帶和半干旱區(qū)為苜蓿最佳生長區(qū)，苜蓿種植遍及我國北方14個省區(qū)，種植面積達280萬hm2，對我國農(nóng)牧業(yè)發(fā)展起到了重要作用［2］。同時，苜蓿具有抗干旱、耐鹽堿、抗風沙、喜光照等特點，又是改良土壤、防止水土流失、保護生態(tài)環(huán)境的草種之一。

國內(nèi)外已在苜蓿引種栽培、穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)、病蟲害防治、遺傳育種以及抗逆性等方面都做了不少的研究。其中，苜蓿的生態(tài)適應性研究一直是人們關注的焦點。目前，有關苜蓿生態(tài)適應性的研究和報道很多，研究領域逐漸從形態(tài)水平過渡到生理生化以及分子生物學水平［3－7］。

苜蓿生育期需水較多，通常比禾本科多2倍，每形成1g干物質需水700～800g，田間需水量達5 855m3／hm2［8］。而我國北方苜蓿主栽區(qū)干旱缺水，因此，苜蓿的抗旱性研究顯得尤為重要。幼苗期是植物生長發(fā)育過程中的一個非常重要的時期，幼苗期抗旱性能的強弱直接影響到植物能否順利完成整個生育期，故在實際生產(chǎn)中常說“保苗是關鍵”。本研究選擇10個苜蓿品種，用PEG－6000溶液人工模擬干旱處理，在其幼苗期分析其葉片細胞膜透性，丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、類胡蘿卜素（Car）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性研究其抗旱性，并探尋苜蓿幼苗期抗旱的生理生化規(guī)律，以期為苜蓿的選種栽培、優(yōu)化育種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 供試苜蓿品種及其來源見表1。

1．2 試驗設計 在20℃室溫下（經(jīng)實測，試驗期內(nèi)水培室溫度為17～24℃），采用Hoagland營養(yǎng)液配方水培10個品種苜蓿幼苗90～100株。水培裝置包括：營養(yǎng)液盆、水培筐、沙網(wǎng)、碎石、細砂。播種前以上設備和材料均在90℃高溫下滅菌5h，苜蓿種子經(jīng)HgCl2消毒。當幼苗長至三到四葉期時進行干旱脅迫。試驗設置5個水勢：0（CK）、－0．3、－0．6、－0．9和－1．2MPa。處理后每2d進行稱量補水以維持溶液濃度。處理后第7天取樣，取樣時間為08：00－10：00。除細胞膜透性即時測定外，其余樣品均迅速冷凍在－20℃的低溫冰箱中，以備測定其余指標。

表1 供試苜蓿品種及其來源

不同水勢所需PEG－6000溶液的量計算公式［9］如下：

式中，ΨS為溶液的水勢（MPa）；C 為PEG－6000溶液的濃度（g／kg）；T 為溫度（℃）。

1．3 測定方法 指標測定參照李合生［10］、張志良和翟偉箐［11］、高俊風［12］的方法。采用電導率儀法測定細胞膜透性；采用TBA－MDA顯色法測定MDA含量；采用酸性茚三酮法測定Pro含量；采用95%乙醇提取法測定Car含量；采用氮藍四唑光還原法測定SOD活性。

1．4 數(shù)據(jù)分析 采用DPS v8．01和Excel 2003軟件數(shù)據(jù)處理與分析。

目前，模糊數(shù)學中的隸屬函數(shù)法被廣泛應用在品種抗逆性評價。隸函數(shù)法避免了利用單一指標進行抗逆性評價所帶來的片面性，它能綜合所有指標，并在權重統(tǒng)一的情況下，對不同種或品種進行抗逆性排序，使評定結果更客觀全面地接近實際情況。隸屬函數(shù)的分析方法如下：

式中，Yij為i品種的j指標的隸屬函數(shù)值；Xij為i品種的j指標的均值；Xj，max為各品種j指標均值的最大值；Xj，min為各品種j指標均值的最小值。若j指標與抗旱性呈正相關，則用公式（2）；若j指標與抗旱性呈負相關，則用公式（3）。

2 結果

2．1 干旱脅迫對苜蓿幼苗葉片細胞膜透性的影響 隨著干旱脅迫的加劇，苜蓿幼苗葉片的細胞膜透性總體呈上升趨勢。水勢從0到－1．2MPa，葉 片 細 胞 膜 透 性 均 值 為 17．11%、18．50%、28．53%、42．75%和44．82%。隨著水勢的降低，細胞膜透性的變化呈現(xiàn)出明顯的兩個拐點，即－0．3和－0．9MPa水勢。當水勢高于－0．3MPa時，與對照相比細胞膜透性變化不大；當水勢低于－0．3 MPa時，細胞膜透性開始大幅增加，表明苜蓿幼苗開始受到較為嚴重的干旱脅迫；當水勢降到－0．9 MPa時，細胞膜透性較對照增加了149．85%；當水勢低于－0．9MPa時，細胞膜透性的增幅開始下降，－1．2MPa水勢的細胞膜透性只比－0．9MPa的增加了4．84%（圖1）。結果表明，當水勢在－0．9 MPa左右時，苜蓿幼苗葉片的細胞膜可能已被完全或接近完全破壞。苜蓿幼苗抗旱葉片細胞膜透性變化的臨界值可能在－0．9MPa水勢附近。

圖1 干旱脅迫第7天時苜蓿幼苗葉片細胞膜透性的變化

2．2 干旱脅迫對苜蓿幼苗葉片中丙二醛含量的影響 水勢從0到－1．2MPa，葉片中MDA含量的均值分別為0．011 0、0．011 9、0．017 6、0．015 8和0．014 8μmol／g（表2）。總體看來，隨著水勢的降低，MDA含量呈上升趨勢，且10個品種間MDA含量差異顯著（P＜0．05）。當水勢為－0．3MPa時，MDA含量與對照相比變化不大；當水勢降到－0．6MPa時，MDA含量達到最大值；當水勢低于－0．6MPa時，MDA含量不升反降但仍高于對照。結果表明，當水勢達到－0．6MPa時，苜蓿幼苗葉片中的膜脂過氧化作用已接近峰值。苜蓿幼苗抗旱的臨界水勢可能介于－0．9～－0．6MPa。

2．3 干旱脅迫對苜蓿幼苗葉片中脯氨酸含量的影響 隨著水勢的降低，苜蓿幼苗葉片中Pro含量總體呈先降后升的變化趨勢，且10個品種間Pro含量差異顯著（P＜0．05）。水勢從0到－1．2 MPa，葉片中Pro含量的均值分別為104．17、75．28、184．89、289．54和248．23μg／g（圖2）。當水勢為－0．3MPa時，Pro含量較對照下降27．73%；當水勢低于－0．3MPa時，Pro含量開始上升；當水勢下降到－0．9MPa時，Pro含量較對照上升177．95%；當水勢低于－0．9MPa時，Pro含量又略呈下降趨勢?？赡墚斔畡葸_到－0．9MPa時，苜蓿幼苗葉片細胞中的Pro滲調機能已達極限。苜蓿幼苗抗旱的臨界值可能在－0．9MPa水勢左右。

表2 干旱脅迫第7天時苜蓿幼苗葉片中丙二醛含量的變化 μmol／g

圖2 干旱脅迫第7天時苜蓿幼苗葉片中脯氨酸含量的變化

2．4 干旱脅迫對苜蓿幼苗葉片中類胡蘿卜素含量的影響 在干旱脅迫下，苜蓿幼苗葉片中Car含量呈上升趨勢，且10個品種間Car含量差異顯著（P＜0．05）。水勢從0到－1．2MPa，葉片中Car含量的均值分別為0．071 0、0．103 5、0．111 0、0．138 0和0．119 6μmol／g（表3）。當水勢下降到－0．9MPa時，Car含量達到最大值，較對照增加94．37%；當水勢繼續(xù)下降時，Car含量呈下降趨勢。結果表明，當水勢降到－0．9MPa時，苜蓿幼苗葉片細胞中的抗氧化物質的抵御能力可能已達極限。苜蓿幼苗抗旱的臨界值可能在－0．9MPa水勢左右。

表3 干旱脅迫第7天時苜蓿幼苗葉片類胡蘿卜素含量的變化 μmol／g

2．5 干旱脅迫對苜蓿幼苗葉片中超氧化物歧化酶活性的影響 隨著干旱脅迫的加劇，苜蓿幼苗葉片中SOD活性總體呈先降后升再降的變化趨勢。水勢從0到－1．2MPa，葉片中SOD活性的均值分別為143．36、96．87、77．07、244．59和98．53 U／g（圖3）。當水勢為－0．3和－0．6MPa時，SOD活性均低于對照；當水勢下降至－0．9MPa時，SOD活性大幅升高，較對照增加了70．61%；而當水勢進一步下降，SOD活性又大幅下降，－1．2MPa水勢時的SOD活性較對照下降了31．27%。可能當水勢降至－0．9MPa時，苜蓿幼苗葉片細胞中SOD活性被完全激活；而當水勢進一步降低，細胞可能已難以抵御干旱脅迫，導致SOD活性下降。苜蓿幼苗抗旱的臨界值可能在－0．9MPa水勢左右。

圖3 干旱脅迫第7天時苜蓿幼苗葉片內(nèi)超氧化物歧化酶活性的變化

2．6 苜蓿品種抗旱性綜合評價

上述抗性指標的分析只能表明10個苜蓿品種在干旱脅迫下總的生理響應過程，而難以判斷出具體品種的抗旱性強弱，這就需要借助數(shù)學方法來分析。根據(jù)隸屬函數(shù)的分析方法，利用本試驗所測的5個抗旱指標在不同水勢下的均值，計算出10個苜蓿品種不同指標的隸屬函數(shù)值，并再求其平均值，最后根據(jù)隸屬函數(shù)的平均值進行排序，得出10個苜蓿品種的抗旱性強弱（表4）；依次為德國德貝＞大富豪＞阿爾岡金＞W(wǎng)est blend＞FGZT 106＞苜蓿王1＃＞皇后2000＞愛菲尼特＞新疆大葉＞四季旺。

3 討論

植物的抗旱機制涉及到一個復雜的體系，單一的指標很難說明某種植物（品種）的抗旱性的強弱，必須測定多種指標，并在此基礎上作出綜合評判。本研究所選的指標均是目前較常用且與抗旱性密切相關的生理生化指標，盡管隨著研究進一步的深入，人們對于某些指標與抗旱性的關系產(chǎn)生了疑問。但可以肯定的是，這些指標與抗旱性是相關的，只是它們之間的關系可能并不是以前人們所認識的那樣呈簡單的線性關系。

表4 各抗旱指標的隸屬函數(shù)值及10個苜蓿品種綜合抗旱性排序

本研究表明，在－0．9MPa水勢時，各測試指標的變化趨勢均出現(xiàn)了明顯的轉折點，說明－0．9 MPa可能是苜蓿幼苗耐旱的關鍵水勢點，同時苜蓿幼苗耐旱的極限可能是在一個范圍內(nèi)。根據(jù)本研究結果可以推斷出苜蓿幼苗抗旱的臨界值在－0．9 MPa水勢左右。此外，值得注意的是，細胞膜透性及丙二醛含量在－0．3MPa水勢時與對照相比變化不大，而脯氨酸含量與超氧化物歧化酶活性均在－0．3MPa水勢時下降。這些變化表明苜蓿幼苗在－0．3MPa水勢下幾乎沒有受到干旱脅迫的傷害。這可能是由于苜蓿本身具有較強的抗旱性，或者是由其他生理原因造成［13］。

目前對于游離脯氨酸是否適宜作為抗旱性指標的爭議是最多的。最大的疑問在于，干旱脅迫下，游離脯氨酸的累積途徑有很多，既可能有適應性的意義，又可能是細胞結構和功能受損傷的表現(xiàn)［14］。由此可見，脯氨酸的積累與植物的抗旱性之間可能并不是簡單的正相關關系。但脯氨酸在干旱脅迫下大量積累，證明了其對干旱的敏感性，本研究也證實了這一點，因此還是可以把它作為評判品種抗旱性強弱的指標或者參數(shù)。但是，在本研究中也出現(xiàn)了隨著脅迫的加劇，某些苜蓿品種的脯氨酸含量呈下降趨勢的現(xiàn)象，這可能是苜蓿幼苗對于干旱脅迫的一種適應性反應，其葉片可能產(chǎn)生了暫時的生理休克［15］。

多項研究表明［16－18］，植物在遭受逆境脅迫時，其體內(nèi)類胡蘿卜素含量和超氧化物歧化酶活性均會上升，本研究也證實了這一點。一般認為，抗性較強的品種其葉片中類胡蘿卜素的含量較高，并且具有較高的超氧化物歧化酶活性。但在本研究中，隨著干旱脅迫的加劇，類胡蘿卜素含量和超氧化物歧化酶活性出現(xiàn)下降，這可能是由于抗氧化保護系統(tǒng)的抵抗修復能力是有一定閾值的［19］，當脅迫超過一定程度后，抗氧化保護系統(tǒng)也將失去保護作用。此外，抗氧化系統(tǒng)保護能力的強弱并不在于單個物質的活性大小或含量多少上，關鍵在于它們之間的協(xié)同性是否好［20］，因為清除活性氧是分步驟的，抗氧化保護系統(tǒng)中的每種物質只在特定的步驟上起作用。

綜上所述，隨著干旱脅迫的加劇，苜蓿幼苗葉片中細胞膜透性、丙二醛含量和類胡蘿卜素含量總體呈上升趨勢；脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性總體呈先降后升的趨勢；苜蓿幼苗期的耐旱極限范圍可能在－0．9MPa水勢附近；利用隸屬函數(shù)分析得出10個苜蓿品種的抗旱性強弱為：德國德貝＞大富豪＞阿爾岡金＞W(wǎng)est blend＞FGZT 106＞苜蓿王1＃＞皇后2000＞愛菲尼特＞新疆大葉＞四季旺。

［1］ 耿華珠．中國苜蓿［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：25－45．

［2］ 張曉霞，高永革，嚴學兵，等．紫花苜蓿抗熱性鑒定與評價的研究進展［J］．草業(yè)科學，2010，27（2）：113－118．

［3］ Zeid I M，Shedeed Z A．Response of alfalfa to putrescine treatment under drought stress［J］．Biologia Plantarum，2006，50（4）：635－640．

［4］ Goicoechea N，Trivedi S，Halshaw L，et al．Influence of carbuncular mycorrhizae and Rhizobium on nutrient content and water relations in drought stressed alfalfa［J］．Plant and Soil，1997，192：261－268．

［5］ Lindsay W B，Aleida H W，Megan H R，et al．Water relations and adaptations to increasing water deficit in three perennial legumes，Medicago sativa，Dorycnium hirsutumand Dorycnium rectum［J］．Plant Soil，2007，290：231－243．

［6］ 姜義寶，李建華，方麗云，等．鈣處理對苜蓿幼苗抗旱性的影響［J］．中國草地學報，2008，30（1）：117－120．

［7］ 徐向南，易津，于林清，等．紫花苜?？购敌匝芯窟M展［J］．中國農(nóng)學通報，2009，25（21）：180－184．

［8］ 曹致中．優(yōu)質苜蓿栽培與利用［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002．

［9］ Michel B E，Kaufmann M R．The osmotic potential of polyethylene glycol 6000［J］．Plant Physiology，1973，51：914－916．

［10］ 李合生．植物生理生化試驗原理和技術［M］．北京：高等教育出版社，2000．

［11］ 張志良，翟偉箐．植物生理學試驗指導［M］．北京：高等教育出版社，2003．

［12］ 高俊風．植物生理學試驗指導［M］．北京：高等教育出版社，2006．

［13］ 孟林，毛培春，張國芳，等．17個苜蓿品種苗期抗旱性鑒定［J］．草業(yè)科學，2008，25（1）：21－25．

［14］ 劉娥娥，宗會，郭振飛，等．干旱、鹽和低溫脅迫對水稻幼苗脯氨酸含量的影響［J］．熱帶亞熱帶植物學報，2000，8（3）：235－238．

［15］ 錢永常，余叔文．大豆對SO2的適應性反應［J］．植物生理學報，1991，17（3）：232－238．

［16］ 鄒琦，李德全，鄭國生，等．作物抗旱生理生態(tài)研究［M］．濟南：山東科學技術出版社，1994．

［17］ 霍學敏，呼天明，楊培志，等．干旱脅迫對苗期紫花苜蓿3種生理指標的影響［J］．草業(yè)科學，2010，27（4）：89－92．

［18］ 張永鋒，梁正偉，隋麗，等．鹽堿脅迫對苗期紫花苜蓿生理 特 性 的 影 響 ［J］．草 業(yè) 學 報，2009，18（4）：230－235．

［19］ 王久生，王根軒．CO2倍增對滲透脅迫下小麥葉片抗氧化酶類及細胞程序性死亡的影響［J］．植物生理學報，2000，26（5）：453－457．

［20］ 韓瑞宏．苗期紫花苜蓿（Medicago sativa）對干旱脅迫的適應機制研究［D］．北京：北京林業(yè)大學，2006．