王旭東,王海珠,徐 華,梁國棟,張 偉,朱寶平,房學(xué)東*,姜洪偉
(1.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院普通外科,吉林長春 130041;2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)院)
本研究探討結(jié)直腸癌組織中RASSF 1A基因啟動子甲基化和mRNA表達(dá)異常與結(jié)直腸癌病理生物學(xué)特征的關(guān)系,為闡明抑癌基因RASSF 1A基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中作用及其分子機(jī)理提供有力科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 標(biāo)本采集我院2009年8月-2010年4月手術(shù)切除結(jié)直癌標(biāo)本90例,均為腺癌,其中男性55例,女性35例,年齡42-78歲,平均62歲。組織來源和分組:分為三組(1)正常組;(2)癌旁組;(3)實(shí)驗(yàn)組。按:①分化程度:分為高、中、低分化組。②腫塊大小:>5 cm和 ≤5 cm。③臨床分期:按照Dukes分期進(jìn)行分組。
1.2 方法
1.2.1 RASSF 1A基因表達(dá)的檢測:RT-PCR方法檢測RASSF 1A基因mRNA表達(dá)。
1.2.2 設(shè)計(jì)引物:針對RASSF 1A基因啟動子甲基化特異性PCR所設(shè)計(jì)的一組引物,使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer3,該引物包括甲基化(Methylated,M)與非甲基化(Unmethylated,U)特異性引物各一對,由寶生物工程(大連)有限公司合成。分別以M、U標(biāo)記,各對引物上下游起始位點(diǎn)、擴(kuò)增片斷大小、引物序列如下:
甲基化引物設(shè)計(jì):
M-上游引物:距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-43 bp至-17 bp
5′-CGTTGTTCGCGATTTTTGGTTTC-3′
下游引物:距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)71 bp至92 bP
5′-ACCGATTACTTTAAAAATACGCG-3′
擴(kuò)增片斷:342 bp
未甲基化引物設(shè)計(jì):
U-上游引物:距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-44 bp至-18 bP
5′-GTTGTTGTTGTTTGTGAITTTTGGTTTT-3′
下游引物:距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)72 bP至99 bP
5′-CCACTTACCAATTACTTAAAAAATACACA-3′
擴(kuò)增片斷:351 bP
1.2.3 MSP測定DNA甲基化:按照試劑盒說明書操作。
1.2.4 PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳:條件為2.5%瓊脂糖凝膠,65 V恒壓電泳1 h 40 min。0.1%嗅化乙錠染色15 min,凝膠成像系統(tǒng)照相分析。
1.2.5 檢測甲基化位點(diǎn)狀況 MSP產(chǎn)物6 μ l及DNA Marker 1 μ l用含有嗅化乙錠1.5%瓊脂糖凝膠(穩(wěn)壓80V)在TBE電泳工作液電泳約20 min,后在紫外燈下觀察結(jié)果,且用UVI凝膠成像系統(tǒng)攝影。
1.3 MSP結(jié)果的判斷甲基化特異性引物擴(kuò)增出產(chǎn)物,為完全甲基化;僅未甲基化特異性引物擴(kuò)增出產(chǎn)物,為未甲基化;兩對引物均擴(kuò)增出產(chǎn)物,為部分甲基化[1]。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件,組間比較用 χ2檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
見表1、2,圖1,2。表1可以看出,1)組和2)組比較,P=0.001,說明RASSF 1A基因啟動子甲基化在癌組織和癌旁組織存在顯著的差異,P<0.05;1)組和3)組比較,P=0.008,說明RASSF 1A基因啟動子甲基化在癌組織和正常組織存在顯著的差異,P<0.05.說明RASSF 1A基因啟動子甲基化結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
圖1 檢測結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及正常組織中總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖
圖2 MSP方法檢測結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及正常組織中RASSF 1A基因啟動子甲基化狀態(tài)癌旁組織和癌組織關(guān)系
表1 RASSF 1A基因甲基化與結(jié)直腸正常組織,
表2可以看出,按組織分化分組(高或中分化腺癌為一組,低或未分化腺癌為一組),兩組的甲基化頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。按浸潤深度分組(T1-T2和T3-T4各為一組),甲基化頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。按臨床分期分組(A和B期和C和D期各為一組),兩組的甲基化頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表2 RASSF 1A基因甲基化與結(jié)直腸癌的關(guān)系
隨著腫瘤研究的深人,人們發(fā)現(xiàn)除了DNA突變等遺傳學(xué)改變外,基因甲基化和組蛋白乙?;炔簧婕癉NA序列改變的表觀遺傳學(xué)機(jī)制在部分腫瘤的發(fā)生中可能起著至關(guān)重要的作用[2]。真核生物DNA甲基化水平與腫瘤關(guān)系密切,啟動子區(qū)高甲基化能導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默,這是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵事件[3]。3p21等位基因缺失發(fā)現(xiàn)了一系列的從小到大的腺瘤的關(guān)系,盡管這樣,這個關(guān)于3p21和RASSF 1A LOH得研究和總體的RASSF 1A基因改變一樣,但是與一系列早期和晚期癌相關(guān)聯(lián),尤其是RASSF 1A基因片段的真實(shí)性[4]。RASSF1A基因定位于3p21,是Ras基因超家族的成員,發(fā)揮著抑癌基因的作用。與啟動子的CpG島甲基化的分析,RASSF 1A的啟動子甲基化在早期結(jié)直腸癌組織中表達(dá)較多[5]。RASSF1A基因定位于3p2113,是Ras基因超家族的成員,發(fā)揮著抑癌基因的作用[6]。RASSF 1A基因改變破壞了細(xì)胞周期、分化、去分化、細(xì)胞凋亡之間的平衡,導(dǎo)致細(xì)胞無控制性生長。早期抑癌基因失活,隨后各種癌基因激活[7]。
本研究得出結(jié)果是:癌組織組和癌旁組比較,P<0.05,說明RASSF 1A基因啟動子甲基化在癌組織和癌旁組織存在顯著的差異;癌組織組和正常組比較,P<0.05,說明RASSF 1A基因啟動子甲基化在癌組織和正常組織存在顯著的差異。高、中分化組和低、未分化組比較,兩組的甲基化頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T1、T2組 和T3、T4組比較,兩組甲基化頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A、B期組和C、D期組比較,兩組的甲基化頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
因此,RASSF 1A啟動子區(qū)CpG島的高頻率的甲基化在結(jié)值腸癌的疾病發(fā)生中起著是非常重要的作用,RASSF 1A基因作為一個抑癌基因,該基因表達(dá)下降可能與結(jié)直腸癌的分化程度和浸潤、轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān),因此該基因在結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制中的作用,成為結(jié)直腸癌的早期診斷以及預(yù)后判斷的很關(guān)鍵的輔助手段,成為結(jié)直腸癌新的腫瘤標(biāo)記物,而甲基化抑制劑也有望成為結(jié)直腸癌治療的新方法。
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