同種異體牙移植的免疫抑制功能研究*

金光春 李言君 周 聰 姜 玲 薛江南 李升鐘 金東春

1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264003；2.韓國(guó)延世大學(xué),首爾 120-752；3.延邊大學(xué)，吉林延吉 133000

異體牙移植免疫排斥反應(yīng)的存在導(dǎo)致牙根吸收、根管治療失敗、繼發(fā)感染等并發(fā)癥，限制了它們的臨床應(yīng)用，是影響移植牙長(zhǎng)期存活的重要因素。如何消除或降低異體牙移植后的免疫排斥反應(yīng)及如何進(jìn)一步提高異體牙移植的成功率，國(guó)內(nèi)外研究者采用不同的方法處理異體牙，亟待解決并發(fā)癥等問(wèn)題。而且報(bào)道不盡相同，尚無(wú)統(tǒng)一的定論[1]。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行同種異體牙移植的研究，減少免疫排斥反應(yīng)，為異體牙移植術(shù)的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

隨機(jī)選擇14只雄性白鼠（28顆上頜左右第1磨牙）為異體牙供者，體重16～24 g。隨機(jī)選擇14只雌性白鼠（28顆上頜左右第1磨牙）為移植牙受體者，體重16～22 g。分成具有相同抗原性和不同抗原性兩類。所有白鼠均經(jīng)過(guò)血液抗原性確認(rèn)，均為4周齡的Sprague-Dawley系，由韓國(guó)延世大學(xué)口腔科學(xué)研究所提供。

1.2 保存溶液

Viaspan溶液(Dupont Pharma,Willmington,DE,USA)

1.3 靶細(xì)胞

采用Sp-20骨髓瘤細(xì)胞。

1.4 生物化學(xué)試劑及反應(yīng)試劑

溴化二苯四偶氮鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-diphenylte-trazoliumbrom ede，MTT]，兔補(bǔ)體，蛋白水解酶。反應(yīng)試劑是采用10%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO/Sigma Chemical Co.,St.Louis,USA）。

1.5 方法

1.5.1 牙移植術(shù) 采用Ketamine（0.1 mL/100 mg, Jaeil Jae Dang,Korea）藥物麻醉后，用探針進(jìn)行牙齦分離，盡量減少對(duì)周?chē)M織損傷的情況下，用特制的拔牙鉗子拔除異體牙供者的左右上頜第1磨牙，移植于受體。

1.5.2 效應(yīng)細(xì)胞的制備 無(wú)菌條件下取出同種異體移植組和接受組白鼠脾臟在骨鑿器上磨碎，收集溢出的淋巴細(xì)胞，使用60% Pecoll充分分離淋巴細(xì)胞。

1.6 組織學(xué)觀察

牙移植術(shù)后分別于1、2、4、8斷頸法處死動(dòng)物（按時(shí)間段處死7只），摘除頜骨，10%福爾馬林固定24 h，在5%硝酸脫敏溶液中脫敏5 d。以牙齒長(zhǎng)軸1 mm的間隔垂直切片，制備5 μm標(biāo)本，用HE染色并觀察牙根吸收程度及周?chē)浦矃^(qū)的免疫排斥反應(yīng)。

牙根吸收評(píng)價(jià)基準(zhǔn)：①normal periodontium（正常牙周膜）；②surface resorption（表面吸收）；③inflammatory resorption（炎癥吸收）；④replacement resorption（復(fù)位吸收）。

1.7 ACMC與CMC免疫反應(yīng)的免疫學(xué)觀察

標(biāo)本二甲苯溶液中浸泡30 min，去除石蠟，用95%、90%、70%酒精與蒸餾水按順序處理，用0.1%胰島素酶處理，露出抗原部位，并在山羊血清中反應(yīng)30 min，應(yīng)用生物素染色（avidin-biotin staining）法免疫組織化學(xué)驗(yàn)色,用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline）清洗并DAB kit顯色，光學(xué)顯微鏡觀察ACMC（宿主主抗體-補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞殺傷）與CMC（細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷）免疫反應(yīng)。觀察期為1周，每個(gè)時(shí)間段的觀察點(diǎn)是7只白鼠，分離血清，制備抗體。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)Student-Newman-Keuls 法計(jì)量數(shù)據(jù),計(jì)量資料用（± s）表示，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

同種異體移植牙術(shù)后1周開(kāi)始觀察大多數(shù)牙根吸收及周?chē)浦矃^(qū)的免疫排斥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)牙根周?chē)鞯拿庖呒?xì)胞反應(yīng)。在牙根周?chē)膯魏思?xì)胞浸潤(rùn)，以及局部淋巴結(jié)內(nèi)產(chǎn)生淋巴母細(xì)胞。移植牙受體區(qū)域纖維血管組織長(zhǎng)入，根尖周?chē)乐茼g帶細(xì)胞大量破壞，組織血管吸收、壞死，大量的T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥反應(yīng)。牙骨質(zhì)呈現(xiàn)大面積的牙根吸收，根吸收區(qū)分布著大量破骨細(xì)胞。分布于骨質(zhì)表面，形成骨吸收窩陷。免疫檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ACMC和CMC反應(yīng)水平牙移植術(shù)后1周開(kāi)始明顯提高，術(shù)后1～2個(gè)月可持續(xù)增加，見(jiàn)圖1。ACMC、CMC與同基因移植牙有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。觀察明顯的牙根周?chē)?，可?jiàn)大量的破骨細(xì)胞分布在牙槽骨吸收陷窩內(nèi)。

表1 同種異體牙移植術(shù)后牙根周?chē)拿庖吲懦夥磻?yīng)(HE與免疫檢測(cè))變化

圖1 牙根吸收程度及周?chē)浦矃^(qū)的免疫排斥反應(yīng)

3 討論

器官移植是指通過(guò)外科手段，將他人的具有活力的器官移植給患者以代替其病損的器官的手術(shù)。20世紀(jì)，器官移植技術(shù)隨著外科手術(shù)、免疫抑制藥物、器官和細(xì)胞分離保存技術(shù)及移植免疫學(xué)基礎(chǔ)的迅速發(fā)展，特別是發(fā)達(dá)國(guó)家現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一門(mén)新興學(xué)科，取得了豐碩的成果和巨大進(jìn)展。牙移植術(shù)是將自體的或異體的牙齒移植到剛拔除的其他牙的牙槽窩內(nèi)，是修復(fù)失牙、恢復(fù)咀嚼功能的有效方法之一。異體牙主要包括因移位、阻生、正畸等需要而拔除的正常牙，異體牙移植因其供體來(lái)源豐富而具有重要意義[2]。

異體牙移植同樣面臨的一個(gè)難題是移植后的排斥反應(yīng)。從Vasilchenko等[4-6]報(bào)道來(lái)看，動(dòng)物異體牙移植實(shí)驗(yàn)或臨床異體牙移植病例的成功率約有9.6%～83.0%。對(duì)于異體牙移植排異反應(yīng)的研究，國(guó)外學(xué)者大多采用非特異性檢測(cè)方法，主要有：①宿主對(duì)來(lái)自同一供體的“二次皮膚移植”的加速排斥反應(yīng)；②受植區(qū)域內(nèi)淋巴結(jié)中免疫淋巴母細(xì)胞的產(chǎn)生。以往的研究認(rèn)為異體牙牙周膜組織所導(dǎo)致的移植免疫反應(yīng)是導(dǎo)致牙根吸收、影響移植牙存活率和存活時(shí)間的重要因素[7-8]。

目前人們常通過(guò)選擇和處理異體牙的組織相容性配型試驗(yàn)來(lái)消除或降低異體牙移植的免疫排斥反應(yīng)。常用的決定受體組織配型方法是ABO血型相容性試驗(yàn)、HLA分型試驗(yàn)及組織相容性交叉試驗(yàn)。Unno等[9]發(fā)現(xiàn)供受體組織相容性抗原一致的異體牙在移植后1年存活率為85.0%，而組織相容性抗原不同的異體牙移植后1年存活率只有31.0%。

近年來(lái)，學(xué)者們移植術(shù)后牙根吸收的并發(fā)癥問(wèn)題進(jìn)行深入研究。Nishimura等[10-11]通過(guò)未根管處理的異體牙移植比經(jīng)根管處理的組織學(xué)觀察，發(fā)生的牙根吸收程度進(jìn)展快速。本研究結(jié)果，移植術(shù)后1周開(kāi)始移植區(qū)根尖部位有根吸收陷窩出現(xiàn)，有破骨細(xì)胞與各種因子協(xié)同作用完成，對(duì)牙槽骨、牙周膜吸收起誘導(dǎo)作用。由于根吸收發(fā)生區(qū)域的不確定性和觀察部位沒(méi)有詳細(xì)定位，無(wú)法做定量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，但從組織切片上可明顯觀察到這一趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)牙移植術(shù)后經(jīng)檢測(cè)ACMC和CMC反應(yīng)，各時(shí)間段觀察細(xì)胞殺傷率均為高，移植區(qū)比較有高度的顯著性差異（P＜0.01）。說(shuō)明異體牙移植具有排斥反應(yīng)。異體牙的CMC在移植術(shù)后2周開(kāi)始就呈現(xiàn)出殺傷水平，但異體牙的ACMC反應(yīng)移植術(shù)后4周開(kāi)始明顯地高于異體牙供者。這說(shuō)明：①牙根表面的牙周膜免疫抑制功能的Fas配體的存在性；②細(xì)胞免疫對(duì)異體牙有免疫排斥反應(yīng)；③實(shí)驗(yàn)中采取的保存溶液、靶細(xì)胞、生物化學(xué)試劑及反應(yīng)試劑不能代表牙移植宿主體內(nèi)實(shí)際的免疫反應(yīng)水平；④異體牙移植具有排斥反應(yīng)。

異體牙來(lái)源豐富，如果找到消除異體牙移植術(shù)后并發(fā)癥的免疫排斥反應(yīng)，將提高異體牙移植術(shù)的成功率，有待今后深層的研究。

[1]Schwartz O,Andreasen JO.Allo-and autotransplantation of mature teeth in monkeys: a sequential time-related histoquantitative study of periodontal and pupla healing[J].Dent Traumatol,2002,18(5)46-261.

[2]Kontalexis S,Papalois A,Bibidakis E,et al.Use of mycophenolate mofetil in the expeimental allo-transplantation of hepatocytes in rats with fulminant hepatic failure[J].Transplant Proc,2004,36(6):1739-1740.

[3]Straffon LH,Pink TC.Trauma to the primary and young permanent dentituons[J].Mich Dent Assoc,2000,82(1):40-45.

[4]Vasilchenko SY,Volkova AI,Ryabova AV,et al.Application of aluminum phthalocyan ine na-noparticles for fluorescent diagnostics in dentistry and skin autotrans- plantology[J]. J Bioph-otonics,2010,3(5-6):336-346.

[5]Cohen AS,Shen TC,Poqrel MA.Transplanting teeth successfully:autografts and allografts that work[J].J Am DentAssoc,1995,126(4):481-485.

[6]Yang ZP,Chang CS.A 3-year follow-up of a homotransplanted tooth from a tooth bank[J].JOE,1990,16(1):34-37.

[7]Bolgül BS,Aakiran E,Celenk S.Autotransplantation of an intruded lateral incisor replacing an avulsed central incisor a case report[J].J Clin Pediatr Dent,2009,34(2):107-111.

[8]Hupp JG, Mesaros SV, Aukhil I,et al.Periodontal ligament vitality and histologic healing of teeth stored for extended periods before transplantation[J]. Endod Dent Traumatol,1998,14(2):79-83.

[9]Unno H,Suzuki H.Pulpal regeneration following allogenic tooth transplant -ation into mouse maxilla[J].Anat Rec,2009,29(4):570-579.

[10]Nishimura K,Amano S,Nakao K,et al.Orthodontic treatment including auto tran- splantation of a mature tooth[J].Angle Orthod,2009,79(2):387-393.

[11]Schwartz O,Andreasen JO.Allo and autotransplantation of mature teeth in monkeys:a sequential time-related histoquantitative study of periodontal and pulpal healing[J].Dent Traumatol,2002,18(5):246-261.