靈芝菌絲體液體深層發(fā)酵研究進展

趙翾

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225）

靈芝菌絲體液體深層發(fā)酵研究進展

趙翾

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225）

靈芝是我國著名藥用真菌，其中的多糖和三萜是有效的抗腫瘤物質(zhì)，但由于野生靈芝很少，種植靈芝周期長，占地廣，受季節(jié)影響，難以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，因而價格昂貴。為了使更多人受惠，利用液體深層培養(yǎng)發(fā)酵靈芝菌絲體是目前的重要發(fā)展方向。本文將對靈芝菌絲體液體深層發(fā)酵進行綜述，并作出展望。

靈芝菌絲體；液體深層發(fā)酵；發(fā)酵工藝

靈芝（Ganoderma lucidum）是我國入藥已達二千多年的著名藥用真菌，屬擔子菌綱、多孔菌目、靈芝科、靈芝屬?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明它對于慢性支氣管炎、冠心病、肝炎、高血脂癥、神經(jīng)衰弱、腫瘤病的輔助治療、白細胞減少癥、硬皮病、皮肌炎等疾病有不同程度的療效[1-4]，而靈芝中的主要藥效成分為靈芝多糖和三萜[2-4]。然而，由于野生靈芝很少，而種植靈芝存在著周期長，占地廣，受季節(jié)影響等制約條件，難以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。另外傳統(tǒng)的靈芝生產(chǎn)以子實體或孢子入藥，靈芝子實體纖維化、木質(zhì)化程度高，苦味濃，靈芝孢子細胞壁厚，不易被人體利用，不適宜于直接作食品、藥品原料[5]。因此以發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝成為當前大趨勢，其中液體深層發(fā)酵技術(shù)有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)率高、生產(chǎn)過程容易控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定且提取分離容易的特點,而且通過液體深層發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌絲體,產(chǎn)品苦味小,營養(yǎng)價值及有效成分不低于子實體甚至有些指標高于子實體,其中菌絲體中的粗多糖及多糖含量均高于子實體，分別為子實體的2.26倍和3.5倍[5]，被廣泛用于許多藥用真菌的生產(chǎn)，在生產(chǎn)靈芝菌絲體方面也備受矚目。因此本文對靈芝菌絲體液體深層培養(yǎng)作了綜述。

1 靈芝生產(chǎn)菌種選育

靈芝種類繁多，我國有記載的靈芝有103種，其中14種已被人們所利用[6]。品種間的不同均可能引起有效成分在產(chǎn)量表達上的差異，因此適合液體深層發(fā)酵的優(yōu)良靈芝菌株的篩選非常必要。夏志蘭等[7]，以8個靈芝菌株為研究對象，比較不同菌株在固體培養(yǎng)基上的菌絲體及液體發(fā)酵的菌球萌發(fā)菌絲生長速度、液體發(fā)酵產(chǎn)物、子實體多糖等指標。結(jié)果表明:8個菌株菌絲體生長速度有一定差異，靈芝G9、紅芝早萌發(fā)且生長速度快，甜芝、紫芝、靈芝G8、血芝其次，靈芝5760、黑芝最慢，其中，血芝次生代謝產(chǎn)物多糖最高。

從自然界分離出的靈芝菌，依靠自身代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，趨向于平衡生長和繁殖，生長速度慢，生產(chǎn)能力低，不能滿足液體深層發(fā)酵對大規(guī)模靈芝生產(chǎn)菌種的要求[5]。為此，李剛等[8]，對靈芝菌株進行原生質(zhì)體紫外誘變育種，成功得到2株多糖含量和產(chǎn)量明顯高于原始菌株的誘變株。另外，也可通過原生質(zhì)體融合的方法，來打破靈芝菌的正常代謝，使之失去自我保守性的調(diào)節(jié)控制，可快速生長而且可大量積累目標代謝產(chǎn)物（如靈芝多糖、靈芝酸等）[5]。

2 培養(yǎng)基選擇

在靈芝發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)基組分的變化會影響靈芝菌絲體活性成分的產(chǎn)生[9]。培養(yǎng)基主要由碳源、氮源、無機鹽和生長因子組成，適當?shù)呐浔群蚿H對靈芝菌絲體發(fā)酵以及多糖的產(chǎn)量有重要影響。

2.1 碳源

真菌菌絲體多利用果糖、葡萄糖等單糖[10]。由于現(xiàn)代社會對清潔生產(chǎn)的關(guān)注，越來越多食品企業(yè)用食品加工行業(yè)的廢渣,如廢糖蜜、淀粉渣等作為碳源。由于靈芝菌絲體是低糖發(fā)酵，糖濃度過高使溶液滲透壓過高，菌絲體中的水分會被吸到溶液中去，造成細胞脫水死亡[11]。胡煥榮[11]通過對20批容積為10m3，定容為7.5 m3發(fā)酵罐的正常實驗發(fā)現(xiàn)，總糖不能超過3.5%，特別是還原糖（葡萄糖）的用量不能超過3%。一般選擇總糖量在3%左右，還原糖控制在1.5%左右。劉冬等[12]對15種常用碳源作了研究對比，發(fā)現(xiàn)單糖碳源以葡萄糖、二糖以蔗糖、多糖以玉米粉等為最適碳源，靈芝菌絲體在液體培養(yǎng)基中的生長速度以在葡萄糖培養(yǎng)基中最快,蔗糖次之,多糖最慢。李平作等研究了產(chǎn)胞外多糖的碳源構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)除葡萄糖之外，玉米粉和酒糟等復(fù)合碳源也有促進增產(chǎn)的優(yōu)勢[13]。相繼研究也證實使用復(fù)合碳源對提高發(fā)酵靈芝多糖和靈芝酸的產(chǎn)量有利[14-16]。

2.2 氮源

氮源是靈芝菌絲體發(fā)酵的重要物質(zhì)，氮源過少會導(dǎo)致菌絲體生命力較弱，出現(xiàn)菌絲體提前自溶。在靈芝液體深層發(fā)酵中一般采用有機氮源，如黃豆餅粉、花生餅粉、棉子餅粉、水解植物蛋白、蛋白胨、氨基酸、酵母粉、酵母膏、麥麩等。氮源限制或過量對菌絲體生長不利，且限制供應(yīng)可提高低分子量多糖的含量[17]。培養(yǎng)基總氮濃度通常保持在0.04%～0.1%[18]。無機氮源中以硫酸銨為最適氮源,有機氮源中以黃豆餅粉等為最適氮源，最適碳氮比以在（23.6～31.1）∶1[12]。一般使用復(fù)合N源較好。以玉米粉，豆餅粉，麩皮和山藥的混合物作為氮源,菌粉得率達到（31.2±1.4）g/L[18]，而使用酵母膏和蛋白胨混合氮源比使用任一單一氮源時的靈芝多糖和靈芝酸產(chǎn)量都有明顯增加[19-20]。

2.3 無機鹽

從大型真菌生理上講，鉀對糖酵解有促進作用，磷酸鹽不足可能會抑制糖代謝，此外，鎂離子含量太少會影響碳源的氧化[10]，故靈芝生長需要的無機鹽中磷、鎂、鉀最為重要。實踐證明，只要加入磷酸二氫鉀0.12%，硫酸鎂0.04%，就能達到靈芝菌絲體的生長要求[11]。

2.4 生長因子

靈芝菌絲體生長中需要一定量維生素類物質(zhì)，特別是VB1，它在靈芝生長過程中不能自己合成，必需從外界補充。實踐證明，在培養(yǎng)基中加入VB150 mg/L，能促使菌絲體生長粗壯[11]。

2.5 pH

靈芝菌絲體液體深層培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)液的pH對菌絲的生長有較大的影響,靈芝菌絲體生長過程中要求培養(yǎng)最適宜的起始pH為6.0～6.5[21]。當pH低于3.5時，菌絲體就停止生長，并產(chǎn)生自溶現(xiàn)象。實際生產(chǎn)過程中培養(yǎng)基采用自然狀態(tài)時，即pH為5.5～6.5。當菌絲體的pH降到3.5時，其靈芝菌絲體中多糖含量已達到設(shè)計要求，故培養(yǎng)基中不再加入酸堿緩沖劑[11]。

2.6 培養(yǎng)基滅菌

罐內(nèi)空消，蒸汽壓力為1.5 kg/cm2。罐內(nèi)實消，夾層加熱至100℃，直接加熱至120℃，蒸汽壓力為1 kg/cm2，保溫30 min。

3 發(fā)酵工藝

3.1 斜面菌種活化

將靈芝菌絲塊接種于母種斜面培養(yǎng)基上,在溫度26℃～28℃下培養(yǎng)6 d，活化1次[22]。

3.2 搖瓶培養(yǎng)

500 mL搖瓶裝發(fā)酵液120 mL，接種4塊0.5 cm2的等量菌塊，使氣生菌絲一面向上懸浮。置于培養(yǎng)箱內(nèi)，在溫度28℃下靜置培養(yǎng)24 h。然后放入往復(fù)式恒溫振蕩器內(nèi)，在溫度25℃下，125次/min振蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng)5、6、7 d，將長滿靈芝菌絲球的一級菌種接入各組培養(yǎng)基中（接種量約10%），置于往復(fù)式恒溫振蕩器內(nèi)培養(yǎng)[22]。

3.3 種子罐培養(yǎng)液培養(yǎng)

在50L全自動不銹鋼種子罐中裝30L種子液，121℃消毒30 min，冷卻后采用火焰接種搖瓶種子液，接種量為10%（即：搖瓶種子培養(yǎng)液3000 mL）。培養(yǎng)條件：（28 ±1）℃，攪拌：150 r/min，罐壓：0.2 kg/cm2～0.3 kg/cm2，pH控制在5.4[23]，空氣流量：1∶1（體積比），培養(yǎng)時間：60 h左右，待菌絲球濃度6%左右（離心菌球和種子液重量百分比），并有濃郁的清香味，鏡檢菌球成魚卵大小，菌絲鎖狀聯(lián)合，無污染，生長旺盛的種子液即為合格的種子罐培養(yǎng)液[24]。

3.4 500 L罐發(fā)酵培養(yǎng)及放罐標準

在500 L全自動不銹鋼發(fā)酵罐裝發(fā)酵液300 L，121℃消毒30 min，冷卻后接種子罐培養(yǎng)液30 L，接種量10%。發(fā)酵條件：罐溫（28±1）℃，罐壓:0.2 kg/cm2～0.3 kg/cm2，pH 控制在5.4，攪拌：150 r/min～200 r/min，通氣量：1∶0.3～1.0（體積比），溶氧控制:100%～90%[25]，發(fā)酵周期:70 h。放罐標準：菌絲球濃度30%，殘?zhí)牵?%以下，氨基氮：50 mg～100 mg左右，溶磷：380μg/mL左右，pH 降至3.0左右[24]。

4 生產(chǎn)過程中的影響因素

4.1 接種方式和接種量對發(fā)酵的影響

在接斜面種于搖瓶中時，有2種接種方式，一種是塊接法，一種是用接種鏟刮斜面。前者往往僅能得到十幾個菌絲球，需要10 d甚至更長的時間才能得到適宜的種子，而后者則會得到非常多的菌絲球，菌絲球生長要迅速得多，6 d～7 d可得到生長良好的種子[26]。接種量是整個發(fā)酵的關(guān)健所在，靈芝深層培養(yǎng)菌種的菌齡一般為48 h左右[27]，始終保持在接種量10%，能大大提高設(shè)備的利用率，降低了發(fā)酵周期，減少了雜菌污染機會[11]。

4.2 發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH變化和裝液量對發(fā)酵的影響

深層發(fā)酵培養(yǎng)要求一定的pH范圍，靈芝菌絲生長的最適pH為5.0～6.0，隨著發(fā)酵的進行pH總體下降。發(fā)酵初期pH為4.0～5.4，到了發(fā)酵中期菌絲體生長旺盛，菌絲干物質(zhì)和有效成分的積累，pH急劇下降到2.5～3.5之間，進入發(fā)酵后期菌絲生長緩慢，出現(xiàn)菌體自溶，pH回升。發(fā)酵過程中pH的變化和培養(yǎng)基的組成有密切的關(guān)系。在發(fā)酵過程中遇到pH急劇下降或上升，可通過選擇合適的培養(yǎng)基，或控制加入酸或堿（氨）量，或加入磷酸鹽、磷酸鈣等緩沖物質(zhì)來調(diào)節(jié)pH。工業(yè)生產(chǎn)上一般采用磷酸鈣就可達到緩沖的目的[5]。

裝液量對發(fā)酵過程也有影響。裝液量越多，通氣量就少，培養(yǎng)基中溶解的氧也少，使得菌球直徑變大。氧對多糖合成有較顯著的促進作用，而通氣量對生物量和多糖含量影響很顯著。研究發(fā)現(xiàn)，裝液量為32%為佳[28]。

4.3 攪拌供氧對發(fā)酵的影響

發(fā)酵中的不同階段，培養(yǎng)液中需氧和供氧情況都在變化，發(fā)酵開始0～8 h靈芝菌的需氧和供氧保持平衡，8 h～64 h發(fā)酵液溶氧降低，靈芝菌的需氧量大于供氧能力，在此階段，菌體處在對數(shù)生長期，黏度一般在這個時期也會出現(xiàn)高峰階段。所以64 h后加大攪拌槳的攪拌速度[24]。攪拌槳轉(zhuǎn)速慢，培養(yǎng)基內(nèi)的溶氧量少，菌球過大，而菌球中間的菌絲不能接觸大量的氧氣，處于饑餓狀態(tài)，影響菌絲的生物量，轉(zhuǎn)速提高菌體受到剪切力增強，使得菌球邊緣的菌絲不斷斷裂成短菌絲，分散在培養(yǎng)基中。但轉(zhuǎn)速不能太高，否則使正在生長的菌絲產(chǎn)生機械損傷，影響多糖的形成。綜合考慮各指標確定攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min[28]。另外，加長攪拌葉直徑，都可改善通氣，還可根據(jù)培養(yǎng)基的性質(zhì)決定攪拌器的形式、攪拌流型等問題。靈芝菌絲體深層培養(yǎng)基黏度大、液面高，為了達到良好的攪拌效果，常采用兩檔或三檔攪拌器，大型發(fā)酵罐多至四檔[5]。但是機械攪拌會造成的大量泡沫。消除泡沫的方法有機械消沫和消沫劑消泡2種。機械消泡的優(yōu)點在于不需要從外面加入物質(zhì)，因此，減少了染菌的機會。但消泡效果不如消泡劑迅速可靠。靈芝深層培養(yǎng)的消泡劑為植物油，如豆油，用0.03%～0.035%，加油過量對菌絲體生長和代謝有一定影響。一般在培養(yǎng)基滅菌之前加入適量植物油外，在培養(yǎng)過程中若有泡沫上升可少量多次添加，但盡量少加油或不加油，而其他合成消沫劑不宜采用[5]。另外還可加入少量玻璃球來切斷菌絲球表面的菌絲增加發(fā)酵點[28]。

4.4 溫度的影響

溫度能影響靈芝多糖的產(chǎn)量。在發(fā)酵過程中，前期0～30 h以稍高的溫度促進菌絲迅速生長，這樣可縮短非生物合成的周期。在30 h～150 h以稍低的溫度盡可能延長有效物質(zhì)的分泌期。150 h以后，溫度稍微提高，以刺激有效物質(zhì)的分泌。后期提高溫度會促使菌絲較快衰老，但因接近放罐，影響不大[5]。

5 展望

靈芝屬種質(zhì)資源十分豐富,但是目前對靈芝的研究主要集中在赤芝（Ganoderma lucidum）和松杉靈芝（Ganoderma tsugae）2個種上，還有大量的物種資源尚待開發(fā)[29]。因此，加強對其他靈芝品種的研究，必會有意外的收獲。另外，不同種、不同菌株間多糖和三萜的產(chǎn)量差異明顯，藥性差別大[30-32]。因此高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的篩選是重要的研究方向，但是，目前多以菌絲產(chǎn)量、多糖產(chǎn)量和三萜產(chǎn)量為目標來篩選菌株，以藥理活性為目標的篩選較少[33]。以藥理活性為篩選目標的靈芝菌株研究應(yīng)該成為今后靈芝生產(chǎn)菌株的研究方向。靈芝子實體和菌絲體間產(chǎn)生藥理活性物質(zhì)有一定的差異，加強有關(guān)方面的研究，加強藥活性物質(zhì)的合成途徑的研究，從而優(yōu)化生產(chǎn)。生產(chǎn)過程中，各種酶的活性影響著多糖和三萜的產(chǎn)量，目前靈芝菌絲體發(fā)酵中各種酶的活性和培養(yǎng)基組分、濃度的關(guān)系尚不清楚，加強該方面的研究可進一步優(yōu)化培養(yǎng)基配比，甚至可選擇性生產(chǎn)所需要的藥理活性物質(zhì)。

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Summarization of Deep-Liquid Fermentation of Ganoderma Lucidum Mycelia

ZHAO Xuan
（The College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agricultural and Engineering，Guangzhou 510225，Guangdong，China）

As the great source of a group of tripenes and biologically active polysaccharides，Ganodema lucidum were used as an anti－tumor medicine and cure some types of cancer.So it enjoyed special veneration in Asia.However，because of the lack of wild one and the difficulty of the cultivation，deep－liquid fermentation was an alternative method.This method in processing Ganoderma Lucidum mycelia will be summarized in this paper.

Ganoderma Lucidum Mycelia；deep－liquid fermentation；zymotechnique

趙翾（1977—），女（漢），講師，博士，研究方向：發(fā)酵工程。

2011-03-10