槐角中黃酮化合物的提取分離研究

申艷艷,汪海峰,張妮萍,許茜

(1.東南大學公共衛(wèi)生學院,江蘇南京 210009;2.南京財經大學食品科學與工程學院,江蘇南京 210003)

中藥槐角為豆科植物槐(Sophora japonica L)的干燥成熟果實,傳統(tǒng)醫(yī)學認為槐角具有清熱瀉火、涼血止血的功效,為《中華人民共和國藥典》歷版所收錄?；苯侵幸阎Y構的黃酮化合物已有30余種,具有很高的藥用價值,在食品、化妝品等行業(yè)中廣泛應用。隨著市場需求量的增加、經濟效益的提高,從天然產物槐角中提取分離黃酮類化合物已日益引起重視。為促進對槐角中黃酮化合物研究與開發(fā),現(xiàn)對槐角黃酮化合物提取和分離方法的研究進展進行綜述,以期對其開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 槐角中黃酮類化合物的提取

1.1 按提取溶劑不同分類

天然黃酮類化合物多以苷類形式存在,并且由于糖的種類、數(shù)量、聯(lián)接位置及聯(lián)接形式不同,可以組成各種各樣的苷類。黃酮苷由于羥基的引入,將增加在水中的溶解度。少量黃酮化合物以苷元形式存在,難溶或不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑中。因此,選用不同的溶劑提取得到的產物略有不同,產率也稍有差異。

1.1.1 水溶劑提取 黃酮苷類物質在水中的溶解性較好,通常可以采用水溶劑提取,在提取過程中要考慮加水量、浸泡時間、煎煮時間及煎煮次數(shù)等因素。冉曉燕等[1]利用水溶液浸提方法將槐角中總黃酮提取出來。最佳提取條件是:槐角與料液(水)比例為1∶8,溫度為90℃下浸提2次,每次2 h。馮愛青等[2]以豫西山區(qū)的槐豆為原料,研究熱水提冷析出法提取蘆丁的最佳工藝條件:在粉碎槐豆中加入8倍量的水浸提30 min,抽濾,再加入5倍量的水浸提20 min后抽濾,濾液靜置10 h,析出沉淀,過濾,干燥得到粗蘆丁,將粗蘆丁用甲醇進一步浸提得到純度高達48%的精制蘆丁。該工藝提取率達18%,高于傳統(tǒng)的堿提酸沉法2倍。

該方法成本低、安全,適合于工業(yè)化大生產。但收率很低,并且由于水的極性大,易把蛋白質、糖類、無機鹽等易溶于水的成分提取出來,因此易霉變,一般提取液存放10 d左右就會有發(fā)霉、變質現(xiàn)象,提取液過濾、濃縮等操作困難且費時,固體黃酮含量低。

1.1.2 有機溶劑提取 目前國內外廣泛使用有機溶劑提取法得到目標物質,乙醇和甲醇是提取黃酮類化合物的最常用溶劑。高濃度的醇(90%～95%)適合提取苷元,60%左右的醇適合提取苷類,提取的次數(shù)一般為2～4次。王景華等[3]分別選取水、丙酮、乙醇等溶劑提取槐角中的總黃酮,只有乙醇提取可以得到較好的得率(63.27%)和黃酮含量(6.84%);采用正交試驗對有機溶劑濃度及用量、提取時間和提取次數(shù)優(yōu)化提取方案。雖然有機溶劑可較好地實現(xiàn)對黃酮化合物的提取,但是有機溶劑有毒,會危害人體和污染環(huán)境,為后續(xù)的處理帶來困難。

1.2 按提取方法不同分類

1.2.1 回流提取法 回流提取法是黃酮化合物提取最常用的方法,所用回流劑通常為水、醇及混合溶劑。此法操作簡便,但效率不夠高,很難一次性完全提取出黃酮化合物。采用索氏提取器便可使得回流劑反復使用,價格低廉且效率高。該法目前已被廣泛用于黃酮化合物的提取,但提取時間較長。

1.2.2 超聲波提取 田中民等[4]比較了超聲波提取法和回流法對槐角中的異黃酮類成分的提取效果,結果表明超聲波提取法相對回流法可使槐角中的槐角苷在更短的時間內溶出。這是由于超聲波具有特殊的生物效應,利用其空化作用,選擇適當?shù)某晠?shù)可以使植物細胞壁間形成較多的小孔,加速細胞內物質的釋放和溶解以及有效成分的浸出,大大提高了提取效率。同時發(fā)現(xiàn)超聲波功率和超聲持續(xù)時間對槐角苷的提取率具有顯著性的影響(P＜0.01),而脈沖寬度和間歇時間對槐角苷的提取率影響不顯著(P＞0.05)。因此,在實際的生產中有必要考察不同功率在不同時間對提取率的影響。

超聲提取法具有提取時間短、效率高、無需加熱等優(yōu)點。但超聲波提取對容器壁的厚薄及容器放置要求較高,否則會影響藥材的浸出效果,目前仍處于小規(guī)模實驗階段,要用于大規(guī)模生產尚需進一步解決有關工程設備的問題。

1.2.3 微波提取法 微波協(xié)同植物有效成分的提取是一種較新的提取技術,與常規(guī)的提取技術相比較,具有高效率、易控制、穿透力強、選擇性高、提取成本低等特點。劉壽林[5]以槐角為原料,甲醇為溶劑,利用微波輻射、回流提取染料木素,考察了微波功率和輻照時間對染料木素的提取率和純度的影響。與傳統(tǒng)的提取工藝對比,提取時間由120 min縮短為40 min,有效成分的提取率提高了3.6%,同時微波制熱還有利于槐角中含量較高的染料木素的苷類向苷元轉化。

1.2.4 亞臨界水提取法 亞臨界水也被稱為過熱水、高溫水、高壓熱水或熱液態(tài)水,是指在一定壓力下,將水加熱到100℃以上臨界溫度374℃以下的高溫,水體仍然保持在液體狀態(tài)(或指壓力和溫度在其臨界值之下的附近區(qū)域的液態(tài)水)。通過對亞臨界水溫度和壓力的控制可以改變水的極性、表面張力和黏度。隨著溫度的升高水的極性會降低,對有機物的溶解能力會增加。常溫下純水的介電常數(shù)約為80,而升溫、升壓至250℃、5 MPa時水的介電常數(shù)降低到27[6],這個值和25℃、0.1 MPa下的乙醇相同,因此極性足夠低,可以溶解許多中等和低極性化合物。叢艷波等[7]通過單因素和正交試驗,以染料木苷為對照、總異黃酮的得率為指標,優(yōu)選出槐角異黃酮的提取工藝參數(shù)。

將亞臨界水提取用于槐角黃酮的提取上,是從槐角中提取黃酮的一種新的探索,這不僅可以避免有機溶劑對黃酮的污染,而且成本低,這對槐角異黃酮的生產利用具有十分重要的意義。

1.2.5 雙水相萃取 雙水相萃取技術是針對生物活性物質提取而開發(fā)的一種新型液-液萃取分離技術,與水-有機相萃取的原理相似,都是依據(jù)物質在兩相間的選擇性分配。當物質進入雙水相體系后,由于表面性質、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的作用以及溶液環(huán)境的影響,使其在上、下相中的濃度不同,即各成分在兩相間選擇性分配,從而達到萃取的目的。與傳統(tǒng)的萃取技術相比,雙水相萃取不會引起生物活性物質的失活,易于工藝放大和連續(xù)操作。

作為一種新型的分離技術,在黃酮化合物的提取方面已有較廣泛的應用[8-9]。Zhang等[10]取一定量的銀杏葉浸提液,25℃加到PEG/磷酸鹽體系雙水相系統(tǒng)中,相比為0.56,則黃酮類化合物進入上相PEG,從而將黃酮化合物富集分離,提取率可達98.2%。除了常用的PEG/無機鹽體系,目前還出現(xiàn)了有機溶劑(丙酮、乙醇)/無機鹽體系、離子液體系。盡管雙水相體系具有分相快、使用溫度低和易于操作等特點,然而依然存在水溶性高聚物大多數(shù)黏度較大、不易定量控制等問題。該方法為槐角中黃酮類化合物提取探索了一條途徑,但在具體應用時仍需作進一步的改善。

2 槐角中黃酮化合物的分離純化

2.1 高速逆流色譜分離法

高速逆流色譜分離法(high-speed countercurrent chromatography,HSCCC)是一種新的分離技術,具有許多傳統(tǒng)的液相色譜分離手段所沒有的其他優(yōu)點:(1)線圈中固定相不需要載體,可避免樣品在分離過程中的因使用載體而帶來的不可逆吸附現(xiàn)象;(2)特別運用于制備性分離,每次進樣體積較大,進樣量也較多;(3)對樣品前處理沒有太多的要求,不必擔心粗樣會污染或損壞分離柱。

Sun等[11]用HSCCC對槐角果皮化學成分進行了較為系統(tǒng)的研究,并從中分離得到6種黃酮化合物,經HPLC測定純度達到90%～99%。槲皮素、山柰酚和異鼠李素是槐角黃酮的主要成分,但由于三者的化學結構相似,特別是異鼠李素和山柰酚很難分離,單體不易制備。經一次常規(guī)HSCCC可將槲皮素與異鼠李素、山奈酚分開,但后兩者不能分離。Yang等[12]利用多維高速逆流色譜分離異鼠李素和山奈酚取得了較好的效果,但需要兩臺高速逆流色譜儀串聯(lián)使用,一般實驗室難以做到。蘇靜等[13]利用一臺高速逆流色譜儀通過循環(huán)閥將待分離部分多次泵入主機中進行循環(huán)分離,成功地分離了銀杏葉中結構類似的異鼠李素和山奈酚。該方法也為槐角中黃酮化合物的分離純化開辟了一條新的思路。

2.2 大孔樹脂

大孔吸附性樹脂主要以苯乙烯、α-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等為原料加入一定量致孔劑甲酰胺聚合而成,多為球狀顆粒。大孔吸附樹脂是吸附性和分子篩性原理相結合的分離材料,它的吸附性是由于范德華力或產生氫鍵的結果。大孔樹脂包含許多具有微觀小球的網狀孔穴結構,顆粒的總表面積很大,具有一定的極性基團,使大孔樹脂具有較大的吸附能力;另一方面,分子篩性是由于其本身多孔性結構的性質所決定。這些網狀孔穴的孔徑有一定的范圍,使得它們對通過孔徑的化合物根據(jù)其分子量的不同具有一定的選擇性。

袁崇均等[14]選取6種大孔樹脂考察其對槐角總黃酮的吸附性能和解吸性能,結果表明D101型大孔顯示出最佳的效能,靜態(tài)飽和吸附量為67.78 mg?g-1,解吸率為97.5%。本工藝使提取液的浸膏量從精制前的35%降低到7.9%,槐角總黃酮含量從18%上升為67%,精制度達到3倍多,同時槐角總黃酮的保留率為93%左右。該工藝簡便可行,可用于制備高含量的槐角總黃酮。還應進一步考察不同條件下的動態(tài)吸附與解吸特征,以適應工業(yè)化大生產的要求,為槐角總黃酮開發(fā)成為降脂的5類新藥提供基礎。

2.3 聚酰胺樹脂

對于分離黃酮類化合物,聚酰胺是較為理想的吸附劑,其吸附強度主要取決于黃酮類化合物分子中羥基的數(shù)目、位置及溶劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小。聚酰胺也是一種價廉易得的化工原料,具有較好的酸堿耐受性,可利用酸堿和高濃度的醇將吸附性極強的雜質洗脫下來使其再生。

吳欣榮等[15]利用聚酰胺顆粒分離純化土茯苓粗總黃酮并考察了靜態(tài)、動態(tài)吸附實驗,在最佳的工藝條件下得到的產物中黃酮含量為71.84%。益母草中的黃酮含量很低,最高僅為0.327%,這使得益母草黃酮的富集和純化難度增大。傳統(tǒng)的大孔樹脂和聚酰胺樹脂精制后的產品純度分別為9%和6.45%;將聚酰胺和大孔樹脂聯(lián)用可充分發(fā)揮各自優(yōu)勢,富集物的純度可以提高到22%[16]。這種方法操作簡便,黃酮富集效率高,具有廣闊的市場前景。

目前市售的聚酰胺吸附劑主要是微米材料,對目標物的吸附作用僅依靠材料表面密布的微孔及數(shù)量有限的活性基團。相比之下,納米材料具有更大的比表面積[17],作用位點的數(shù)量巨大,使得吸附效率和吸附容量大幅提高,少量的納米材料即可望實現(xiàn)對目標物的高效富集。納米顆粒和納米纖維是目前納米材料中的研究熱點,其中納米纖維在材料制備和后續(xù)器件制作方面均較納米顆粒簡便易行,便于推廣應用[18]。此外,納米纖維與其它物質的相互滲透力極強[19],分子在纖維中擴散快,從而縮短了吸附及洗脫時間。本課題組以靜電紡絲法制備了聚酰胺納米纖維作為萃取介質,成功地實現(xiàn)了對雙酚A[20]、鄰苯二甲酸酯[21]、雌二醇、炔雌醇和雌酮[22]的富集。目前聚酰胺在提純槐角黃酮化合物方面的研究尚無相關報道,將聚酰胺納米纖維用于分離純化槐角黃酮化合物有一定的可行性,對此還有待進一步的研究。

3 結 語

從槐角中提取具有生理活性的黃酮作為天然藥物、保健品和化妝品等行業(yè)的原料已日益引起重視,掀起了黃酮類化合物的研究熱潮。隨著科學技術的不斷進步和發(fā)展,黃酮類化合物的提取和分離方法也將得到更加深層的研究和開發(fā),已有的方法將會日趨成熟和完善,各種高效的新方法,尤其是基于納米材料的提取分離技術將會成為研究和應用的熱點之一。

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