生物樣品中唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂的測(cè)定

高 靜

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042）

0 介紹

神經(jīng)節(jié)苷脂是一類(lèi)含有唾液酸的酸性鞘糖脂，是神經(jīng)細(xì)胞膜的重要組成成分，結(jié)構(gòu)中含有一種或多種成分的唾液酸，更確切的說(shuō)，神經(jīng)節(jié)苷脂是由鞘氨基醇與脂肪酸相結(jié)合，然后通過(guò)酰胺鍵連接到包含一種或多種唾液酸的低聚糖鏈上［1］。在物理?xiàng)l件下，唾液酸分子中含有一個(gè)負(fù)電荷，通常以低聚糖，糖脂或糖蛋白的形式存在。近年來(lái)，隨著對(duì)細(xì)胞膜表面糖類(lèi)生理功能研究的日益重視，神經(jīng)節(jié)苷脂的研究也日趨受到科學(xué)界的關(guān)注，特別是隨著神經(jīng)生物化學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)的發(fā)展，對(duì)神經(jīng)節(jié)苷脂的代謝及其生物學(xué)作用研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)的重要課題［2］。神經(jīng)節(jié)苷脂在國(guó)內(nèi)大多數(shù)依賴(lài)進(jìn)口，雖然國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了多種分離純化的方法，但大多都有操作步驟繁瑣、溶劑用量大等不足之處。目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中于其與生物膜其他有效成分之間的相互作用，而對(duì)神經(jīng)節(jié)苷脂的分離方法的最佳選擇未給予詳細(xì)的報(bào)道。因此，本文就多種分離純化方法做一下比較總結(jié)，對(duì)其分離過(guò)程起到一定的幫助。

1 唾液酸

唾液酸的分析從它們釋放時(shí)開(kāi)始，將樣品純化后用不同技術(shù)進(jìn)行分析，下面就對(duì)不同分析檢測(cè)方法做一下介紹。

1.1 樣品制備

1.1.1 唾液酸的提取方式

一般使用兩種方式處理：酸水解及固定化酶處理。

酸水解是應(yīng)用最廣泛的處理方法。用恒溫箱或者加熱器將反應(yīng)保持在加熱條件下（70℃～90℃）。最常用的酸是硫酸濃度為25～100mmol的酸溶液［4］。其他研究者曾經(jīng)將不同的試劑用于水解，如稀釋的鹽酸、微波處理的乙酸、次硫酸鈉或者三氟醋酸，這些都可以減少水解時(shí)間。

對(duì)于不同的酸水解都要做對(duì)照實(shí)驗(yàn)（25mmol HCl，25mmol三氟醋酸TFA，25mmol H2SO4）。用鹽酸或TFA水解是最好的選擇，雖然經(jīng)過(guò)2h的水解會(huì)損失20％左右［5］，但是操作簡(jiǎn)便。通過(guò)從微生物中獲得的神經(jīng)氨酸酶對(duì)唾液酸進(jìn)行水解時(shí)損失最小，但控制生物樣品的反應(yīng)并不容易，因?yàn)樗尼尫乓蕾?lài)于組織結(jié)構(gòu)以及酶的來(lái)源情況。

酶法處理效果比水解的效果要差，因?yàn)椴⒉荒芴崛∷蟹怯坞x唾液酸。相反，酸水解能夠提取所有非游離唾液酸，但是可能會(huì)對(duì)一部分造成破壞，并且能夠參與后面的反應(yīng)過(guò)程，各有利弊。

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)比較，考慮到酶的成本及實(shí)際的反應(yīng)效果，我們認(rèn)為不管是采用色析法還是色度法，酸水解都是最常用的處理方法，因?yàn)檫@種方法重現(xiàn)性好，容易操作且成本相對(duì)較少。

1.1.2 純化

對(duì)于早前的硅酸鹽測(cè)定，陰離子交換柱是純化試樣的最常用的選擇。其他的純化方法還有固體萃取如SepPak C18柱［6］，或者對(duì)樣品進(jìn)行超速離心，一般在水解后用于消除雜蛋白。另外一種可能是將陰離子交換柱與超速離心聯(lián)合應(yīng)用對(duì)樣品進(jìn)行處理，陰離子交換柱是最有效的提純方法，但同時(shí)也是繁瑣且耗費(fèi)大的方法。因此，只有當(dāng)樣品非常復(fù)雜的時(shí)候才使用這種方法。相反，SPE柱可以對(duì)樣品進(jìn)行快速簡(jiǎn)便的分離純化，但只有在干擾因素很小的條件下才適用，因此推薦在純化樣本后使用［7］。

1.2 唾液酸的測(cè)定

1.2.1 分光光度法

考慮到唾液酸的結(jié)構(gòu)與糖類(lèi)似，因此將分光光度法作為測(cè)定唾液酸的專(zhuān)用技術(shù)。但是采用這種方法的缺點(diǎn)是選擇性比較差，如果沒(méi)有之前的純化步驟就不能用此法測(cè)定，而且不能用其區(qū)別不同結(jié)構(gòu)的唾液酸。測(cè)定唾液酸基本上要用到三種比色法：間苯二酚法，丙二酰硫脲測(cè)定法及酶測(cè)定法［8］。

應(yīng)用最廣泛的分光光度法是由Svennerholm發(fā)明的［9］，后人對(duì)這種方法又做了一定的修正，即用陰離子交換法來(lái)提高純度。采用這種方法時(shí)在蔗糖與間苯二酚之間發(fā)生反應(yīng)。由于唾液酸是糖脂類(lèi)神經(jīng)節(jié)苷酯物質(zhì)所含有的特征基團(tuán)，因此當(dāng)與間苯二酚反應(yīng)生成紫色復(fù)合物可用于神經(jīng)節(jié)苷脂的含量測(cè)定。本法主要用于人體組織和生物體液的檢測(cè)，但一些研究者已經(jīng)將其用于乳制品檢測(cè)當(dāng)中，如牛奶制品和嬰兒奶粉的檢測(cè)。

1.2.2 液相色譜法

液相色譜法也是測(cè)定唾液酸較常用的方法，當(dāng)樣品沒(méi)有被衍生化的時(shí)候，最常用的方法就是紫外檢測(cè)離子對(duì)的方法。這種方法最初是由Spyridiaki與Siskos聯(lián)合研究出來(lái)的［10］，他們通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)M提高了以下物質(zhì)檢測(cè)時(shí)的溶出度，包括Neu5Ac，Neu5Gc，N-乙酰基-9-O-乙酰神經(jīng)氨酸等。在分析中使用了多種親脂的陽(yáng)性離子對(duì)，如四辛基溴化銨（TOA-Br）三異丙醇胺（TIP），或者三乙醇胺（TEA）等。使用時(shí)一般選用TIP，因?yàn)樗膹?qiáng)度和分離度更好，但在操作中必須要注意pH的控制，（最佳值為3.5），這是決定因素。但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)這種方法應(yīng)用到血清、尿液、唾液當(dāng)中時(shí)，只能區(qū)分兩種形式的唾液酸（Neu5Ac and Neu5Ac2en）［11］，在純化步驟中必須除去蛋白質(zhì)。由于其限制條件較多，因此在分析結(jié)構(gòu)較多的唾液酸混合物時(shí)不推薦使用本方法。

1.2.3 氣相色譜法

氣相色譜法（GC）與質(zhì)譜法聯(lián)用起初是用來(lái)鑒定苷脂鍵及衍生反應(yīng)后的氧代神經(jīng)氨酸，Zanetta等人在此基礎(chǔ)上研究了一種非常有效的方法，用來(lái)測(cè)定唾液酸標(biāo)準(zhǔn)液及生物體液如馬血清及牛、羊、馬的下顎下腺粘蛋白等［12］。這種方法是在無(wú)水甲醇和使用七氟酸酐形成的揮發(fā)性衍生物存在的前提下，通過(guò)重氮甲烷酐的甲基酯化進(jìn)行氣相色譜/質(zhì)譜電子轟擊的。這種方法能夠區(qū)分大部分的唾液酸，包括O-酰化的Neu5Ac，Neu5Gc和8-O-鄰甲基和8-O-硫酸衍生物以及1，7-唾液酸內(nèi)酯。在后面的研究中，這個(gè)研究小組對(duì)本方法做了小的修改，從而對(duì)單糖、脂肪酸和氨基酸在人的粘蛋白和尿素當(dāng)中可以更好定位。樣品仍可以用相同的反應(yīng)容器，并按照分析唾液酸的方法用GC/質(zhì)譜進(jìn)行分析。相對(duì)于上面的方法，本法的測(cè)定范圍更加全面，其應(yīng)用前景也更加廣泛。

1.2.4 電遷移方法

這種技術(shù)，尤其是毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)（CZE），是應(yīng)用最廣泛的分析檢測(cè)糖類(lèi)結(jié)構(gòu)的方法之一［13］。因此當(dāng)對(duì)唾液酸進(jìn)行測(cè)定時(shí)也很容易操作。在最近的研究中，Ortner與Buchberger發(fā)展了一種簡(jiǎn)便、快捷并且重現(xiàn)性很好的方法來(lái)檢測(cè)人血清和標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白中的Neu5Ac和Neu5Gc［14］，這種方法是CZEMS（質(zhì)譜），本法用對(duì)乙酰氨基酚作為內(nèi)標(biāo)物。CZE和MS的連用檢測(cè)能夠在排除基質(zhì)干擾的條件下定量分析化合物，線性范圍保持在10～100μg/mL內(nèi)，同時(shí)LOD值為2μg/mL。

2 神經(jīng)節(jié)苷脂

2.1 提取、分離、及純化神經(jīng)節(jié)苷脂

在動(dòng)物組織中，最初以及最常用的的提取分離純化方法是由Folch等人研究的［15］。第一步是使用不同比例的氯仿和甲醇提取總脂成分。第二步，將神經(jīng)節(jié)苷脂從此成分中分離純化出來(lái)，利用鹽在水相中的分配比不同提取。這些基本的方法隨著發(fā)展已經(jīng)發(fā)生了一些變化，但最終目標(biāo)都是為了提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量。

2.2 神經(jīng)節(jié)苷脂的測(cè)定

總神經(jīng)節(jié)苷脂量可以通過(guò)分離純化唾液酸內(nèi)容物來(lái)定量，量化結(jié)果可以用脂鍵聯(lián)合唾液酸的方式表達(dá)。

不管總神經(jīng)節(jié)苷脂的鑒別還是定量都需要一種有效的分離方法，主要的方法有薄層色譜法（TLC），高效薄層色譜法（HPTLC）以及層色譜法（LC）［16］。

2.2.1 薄層色譜/高效薄層色譜

薄層色譜法屬于傳統(tǒng)技術(shù)，受到廣泛應(yīng)用。目前，高效薄層色譜法使用的是二氧化硅60，能提供高分辨率來(lái)分離神經(jīng)節(jié)苷脂。不使用以往常用的塑料和玻璃板塊是因?yàn)殚g苯二酚-HCl常會(huì)對(duì)板塊染色，而鋁塊是因其不能抵抗酸的腐蝕。對(duì)于樣品的應(yīng)用，脂類(lèi)結(jié)合的唾液酸推薦量是5～10μg。

關(guān)于顯影劑，總混合物的比例為CHCl3：MetOH：0.2％CaCl2（55：45：5，v/v/v）［17］，在此比例下能夠表現(xiàn)良好的重現(xiàn)性，且能夠分離出最重要的神經(jīng)節(jié)苷脂（GM3and GD3），甚至能在其脂肪酸和鞘氨基醇?jí)A基組成的基礎(chǔ)上分離同種神經(jīng)節(jié)苷脂。

2.2.1.1 經(jīng)典測(cè)定方法

歷史上，第一次用于染色的試劑是地衣酚，因?yàn)樗芘c糖的反應(yīng)連接脂類(lèi)，稱(chēng)粉甲紫染色法。其缺點(diǎn)是對(duì)神經(jīng)節(jié)苷脂不具有專(zhuān)一性。斯文納霍爾姆通過(guò)采用間苯二酚檢測(cè)，在100℃下反應(yīng)15min后，顏色變成了藍(lán)紫色，中性和硫化的神經(jīng)節(jié)苷脂則變成黃棕色，可以說(shuō)這是最有效和敏感的檢測(cè)試劑［18］。神經(jīng)節(jié)苷脂可以通過(guò)與牛腦或其他物種或組織的標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照從而得到鑒定。為了準(zhǔn)確觀察樣品板是否被顯色試劑染色，需要用到光密度計(jì)，可將光密度計(jì)波長(zhǎng)設(shè)為580nm進(jìn)行測(cè)定。這種方法可重復(fù)操作，用于簡(jiǎn)單快速的測(cè)定動(dòng)物組織中的神經(jīng)節(jié)苷脂，甚至被用來(lái)確定細(xì)胞系和在樣品中GM3和GD3以及GT3的神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1，GM2，GM3，GD1a，GD1b和GT1b）。另一種可能性是通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助，在二維高效液相色譜處理后對(duì)密度進(jìn)行成像，通過(guò)圖像分析儀處理間苯二酚染色板和用計(jì)算機(jī)軟件處理，允許測(cè)定GM3，GM1a，GD1a的線性在（r＞0.99）0.01nmol和5nmol之間［19］。光密度測(cè)定方法比電腦成像密度方法更加靈敏和精確。

2.2.1.2 質(zhì)譜分析測(cè)定

質(zhì)譜（MS）能夠利用薄層色譜與高效液相色譜板來(lái)鑒別及定量神經(jīng)節(jié)苷脂，雖然這種方法的靈敏性較TLC/HPTLC免疫染色法低，但這兩種方法都可以作為薄層掃描法測(cè)定神經(jīng)節(jié)苷脂的補(bǔ)充方法。薄層色譜法與快原子轟擊（FAB）及質(zhì)譜連用的優(yōu)點(diǎn)歸因于FAB-MS與氣相、液相及超臨界流體色譜儀是從生物反應(yīng)表面得出結(jié)果的最有效方法［20］。TLCFAB-MS連用效率高且省時(shí)，但條件是仍然需要大分子的解吸附來(lái)增加靈敏度，并盡量減少基質(zhì)中離子源的污染。因此，這種方法對(duì)樣本的要求很高，在實(shí)際的應(yīng)用中也會(huì)受到一定的限制。

2.2.2 液相色譜法與質(zhì)譜法聯(lián)用

近幾年，一項(xiàng)液相色譜法與質(zhì)譜法連用的技術(shù)逐步發(fā)展起來(lái)，實(shí)驗(yàn)證明，這種方法能夠用于牛奶及嬰兒配方中的神經(jīng)節(jié)苷脂中GD3和GM3的測(cè)定。其GD3與GM3的重現(xiàn)性分別小于5％和14％，其覆蓋范圍在83％～87％［21］。由于本法的重現(xiàn)性比較低，所以不建議直接應(yīng)用，在進(jìn)一步研究及改進(jìn)之后，相信本方法會(huì)成為一種可靠的分析方法應(yīng)用到實(shí)際操作中去。

3 結(jié)論

分光光度法不僅可以將生物試樣中的唾液酸進(jìn)行定量分析，還可以將總神經(jīng)節(jié)苷脂量進(jìn)行分析測(cè)定，因此現(xiàn)在仍然是主要的分析方法。其應(yīng)用方式主要為脂類(lèi)與唾液酸的聯(lián)合應(yīng)用。而色譜技術(shù)能夠?qū)煞N主要結(jié)構(gòu)的唾液酸進(jìn)行區(qū)分，這種方法不僅可以測(cè)定樣品的原始數(shù)據(jù)還可以檢測(cè)在臨床環(huán)境中唾液酸代謝情況的變化（如癌癥的早期診斷）［22］。

神經(jīng)節(jié)苷脂在生物試樣中的檢測(cè)都需要一系列冗長(zhǎng)的準(zhǔn)備工作，如提取、分離以及純化工作，但這又是最關(guān)鍵性的操作步驟，因?yàn)檫@些步驟可以從根本上反應(yīng)出實(shí)際的損耗，要將所有干擾源消除非常困難，只能盡量減少。所以在分析過(guò)程中，一定要認(rèn)真將此前期工作認(rèn)真準(zhǔn)備。

TLC/HPTLC仍然是分離神經(jīng)節(jié)苷脂的重要方法。在所有方法當(dāng)中，免疫染色法是鑒別神經(jīng)節(jié)苷脂的最有效技術(shù)，而分光光度法可以實(shí)現(xiàn)定量。但后者由于具有專(zhuān)一性，因此具有更高的靈敏度和容量來(lái)得到結(jié)構(gòu)信息，在實(shí)驗(yàn)操作中也應(yīng)用的更加廣泛。

神經(jīng)節(jié)苷脂測(cè)定的未來(lái)趨勢(shì)是利用質(zhì)譜分析來(lái)闡釋所有結(jié)構(gòu)的神經(jīng)節(jié)苷脂、糖鏈、脂肪酸以及鞘氨基醇，并且調(diào)節(jié)他們的生物活性。本文對(duì)多種分析方法做了分析與比較，為神經(jīng)節(jié)苷脂的開(kāi)發(fā)利用提供了理論和一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，這就是分析所有鑒別方法的意義所在。

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