癌癥"細(xì)菌療法"的研究進(jìn)展

彭文嵐 劉文娜 高靜

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042）

目前的癌癥治療方法主要存在兩個(gè)缺陷：不能有效地定位于目標(biāo)腫瘤和不能有效地穿透腫瘤組織。定位性差限制了標(biāo)準(zhǔn)療法的給藥量，穿透性差使得進(jìn)入腫瘤組織中的藥量減少。這兩個(gè)缺點(diǎn)導(dǎo)致目前的治療方法不能根除所有的腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)［1］。另外，在化學(xué)療法兩個(gè)療程間隔的時(shí)間內(nèi)，個(gè)別癌細(xì)胞會(huì)內(nèi)滲進(jìn)入血管組織而增加轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。癌癥復(fù)發(fā)和并發(fā)癥是目前癌癥病人死亡的主要原因。因此，要想完全治愈癌癥就必須克服這兩個(gè)缺點(diǎn)。細(xì)菌能夠?qū)Ｒ恍缘貎?yōu)先累積在腫瘤的低氧和壞死區(qū)域，經(jīng)基因工程改造后可成為癌癥治療的有效工具。

有效的細(xì)菌療法需要具有能準(zhǔn)確定位于腫瘤組織，從遺傳上入手，無(wú)毒性，瘤內(nèi)定位和有效輸送抗癌藥物等特點(diǎn)［2］。在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌如梭菌屬（Clostridium），沙門氏菌屬（Salmonella），雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和埃希桿菌屬（Escherichia）［5］能特定的在腫瘤組織中積累。對(duì)于毒性和遺傳可操作性，也已經(jīng)做了大量的研究。目前的研究主要關(guān)注的是最后兩項(xiàng)：有效的瘤內(nèi)定位和藥物輸送。另外要做的研究還包括將細(xì)菌與治療載體和抗癌物質(zhì)相結(jié)合。一旦解決了這些問(wèn)題，癌癥"細(xì)菌療法"將取得突破性的進(jìn)展。

1 基因修飾和毒性

為了使細(xì)菌成為有效的抗癌載體，在過(guò)去的10年里進(jìn)行了大量關(guān)于細(xì)菌毒性消除和基因修飾的研究。要使細(xì)菌滿足治療要求，必須對(duì)它進(jìn)行基因修飾。在已研究過(guò)的三種細(xì)菌中，大腸桿菌是基因工程的模式生物，可以進(jìn)行各種程度的基因修飾，沙門氏菌也具有同樣的能力。但梭狀芽胞桿菌屬的使用有一些難度，因?yàn)槔脗鹘y(tǒng)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化方法很難使其發(fā)生改變，需要研究一種新技術(shù)以拓寬梭狀芽胞桿菌屬基因修飾的寬度［6］。

因?yàn)樵S多細(xì)菌本身就有致病性所以必須除去細(xì)菌毒性。1947年，有報(bào)道將溶組織梭菌（Clostridium histolyticus）的芽胞直接注入小鼠移植性肉瘤內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能使腫瘤液化消退，但由于梭菌本身的毒性以及由其介導(dǎo)的溶瘤作用能引起急性毒性反應(yīng)甚至死亡，最后只有極少數(shù)動(dòng)物存活下來(lái)［7］。后來(lái)通過(guò)熱處理除去其致病基因獲得一株諾維氏梭菌（Clostridium novyi）的無(wú)毒菌株，能廣泛定植于腫瘤壞死區(qū)域而不損壞正常組織。缺失msbB-和purI-基因的鼠傷寒沙門氏菌突變體在臨床試驗(yàn)中證明無(wú)毒性［8］，已經(jīng)廣泛用于癌癥研究。也已證明大腸桿菌的減毒型突變體E.coli Nissle 1917無(wú)致病性，可用來(lái)治療癌癥。

2 瘤內(nèi)定位

化學(xué)療法存在的主要問(wèn)題是不能滲透所有腫瘤微環(huán)境，且目前的療法都不能精確的定位在那些存在藥物抵抗力的腫瘤區(qū)域上，而細(xì)菌可以很好的解決這一問(wèn)題。細(xì)菌瘤內(nèi)定位的三種機(jī)理是特殊趨化性、優(yōu)先生長(zhǎng)和厭氧生長(zhǎng)。兼性厭氧菌如沙門氏菌和埃希氏菌主要利用特殊趨化性和優(yōu)先生長(zhǎng)，專性厭氧菌如梭狀芽胞桿菌和雙岐桿菌屬主要利用厭氧生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)其定位目的。這些機(jī)制使得細(xì)菌既可以定位于特定的腫瘤區(qū)域，又不會(huì)傷害正常組織。

正常組織和腫瘤組織的細(xì)胞微環(huán)境和血管結(jié)構(gòu)有很大的不同。在腫瘤組織中由于血流量紊亂造成微環(huán)境異常，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率和藥物濃度梯度改變，出現(xiàn)厭氧和酸性區(qū)域［9］。腫瘤這種獨(dú)特的細(xì)胞微環(huán)境有利于細(xì)菌生長(zhǎng)，這是細(xì)菌具有特殊定位能力的主要原因。

藥物濃度梯度的存在導(dǎo)致某些癌細(xì)胞中的藥物水平不能達(dá)到有效清除濃度［10］。為了克服這種局限性，需要一種有效的藥物輸送方法。大多數(shù)治療法依靠被動(dòng)擴(kuò)散來(lái)輸送藥物，這些方法的腫瘤特異性較高，但是因?yàn)閿U(kuò)散局限性而不能滲透到腫瘤組織內(nèi)部。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）是一種兼性厭氧菌，它可以受腫瘤中不同的微環(huán)境吸引，具有主動(dòng)運(yùn)輸能力，從而克服擴(kuò)散局限性滲透到腫瘤抗性區(qū)域，這種能力使得細(xì)菌成為一個(gè)吸引人的體系。就目前所知，具有運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)菌是唯一能主動(dòng)運(yùn)輸也是唯一能有效注入所有腫瘤組織的治療載體。小鼠模型實(shí)驗(yàn)顯示鼠傷寒沙門氏菌優(yōu)先被腫瘤抗性區(qū)域中瀕死的癌細(xì)胞吸引［11］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸受體控制細(xì)菌向腫瘤移動(dòng)，絲氨酸受體引導(dǎo)細(xì)菌在腫瘤內(nèi)部的滲透，核糖/半乳糖受體引導(dǎo)沙門氏菌進(jìn)入壞死區(qū)域。剔除核糖/半乳糖受體基因能使鼠傷寒沙門氏菌在腫瘤抗性區(qū)域積累，引起癌細(xì)胞死亡。這些發(fā)現(xiàn)表明通過(guò)控制特殊化學(xué)受體的表達(dá)，沙門氏菌可定位于任何腫瘤區(qū)域。

兼性厭氧菌定位于腫瘤組織利用的另外一個(gè)機(jī)理是優(yōu)先生長(zhǎng)。在小鼠模型中，野生型鼠傷寒沙門氏菌優(yōu)先在壞死組織中生長(zhǎng)。通過(guò)改造細(xì)菌使其成為不能在無(wú)營(yíng)養(yǎng)素的微環(huán)境中存活的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌可以控制其定位作用。由靜脈注入后，營(yíng)養(yǎng)缺陷體向含有高濃度營(yíng)養(yǎng)素的腫瘤區(qū)域移動(dòng)并優(yōu)先增殖，但它不能在正常組織中生長(zhǎng)。如鼠傷寒沙門氏菌的亮氨酸/精氨酸突變體能特異的在小鼠前列腺腫瘤中積累［12，13］。

研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌也可定位于含氧量較高的腫瘤區(qū)域和轉(zhuǎn)移灶。鼠傷寒沙門氏菌的好氧菌株在小鼠皮下腫瘤優(yōu)先積累，積累量是在肝和脾中的2000倍。除趨化性和優(yōu)先生長(zhǎng)外，兼性厭氧菌在腫瘤抗性區(qū)域積累的原因還包括由巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞引起的有限的免疫清除［15］。在早期腫瘤中，豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuis）可在肺部轉(zhuǎn)移灶積累而不能在健康的周邊主質(zhì)組織中積累［16］。在常位腫瘤中，當(dāng)用氯氨鉑給藥時(shí)，該菌株可以提高嗜中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤(rùn)作用，具有明顯的抗腫瘤效果［17］。最近的研究顯示，大腸桿菌也可以在腫瘤中積累［18］，且在肝和脾中的積累水平要比腫瘤中低得多。將E.coli K-12注射到小鼠體內(nèi)后，會(huì)迅速引發(fā)抗癌免疫反應(yīng)，從而大大減少肺部轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生。

最易理解的細(xì)菌腫瘤定位機(jī)制是厭氧生長(zhǎng)。當(dāng)將細(xì)菌芽孢由靜脈注入后，專性厭氧菌選擇性的在含氧量低的腫瘤區(qū)域增殖。作為抗癌媒介研究最多的專性厭氧菌是梭狀芽胞桿菌。20世紀(jì)60年代多個(gè)研究證明梭狀芽胞桿菌可在小鼠和人類腫瘤壞死區(qū)域積累。將梭狀芽胞桿菌novyi NT芽孢與化學(xué)療法和抗血管因子聯(lián)合使用，可有效定位于小鼠的無(wú)血管、壞死的腫瘤區(qū)域，減少腫瘤復(fù)發(fā)。將梭狀芽胞桿菌novyi NT與放射療法聯(lián)合使用，可提高治療效果。梭狀芽胞桿菌novyi NT的完整基因組序列顯示其芽孢含有可翻譯成氧化還原蛋白質(zhì)和脂肪酶的mRNA，所以它可以在腫瘤中存活和增殖［19］。非致病性的Clostridium acetobutylicm芽孢經(jīng)血管定位劑考布他汀A-4磷酸鹽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在腫瘤中的生長(zhǎng)有明顯改善。

兼性和專性厭氧菌的定位機(jī)制是互補(bǔ)的。專性厭氧菌對(duì)腫瘤有選擇性，因?yàn)榈脱醐h(huán)境只在腫瘤中存在。這種高度專一性使得它們易于進(jìn)入大型原發(fā)性腫瘤。相反，因?yàn)榧嫘詤捬蹙揽口吇院蛢?yōu)先生長(zhǎng)定位于腫瘤，所以它們能夠定位于轉(zhuǎn)移灶和腫瘤壞死區(qū)域。這種不同的定位機(jī)制使得醫(yī)生可以根據(jù)每個(gè)病人腫瘤的特點(diǎn)來(lái)決定治療方法。

3 可控的給藥途徑

細(xì)菌能夠合成和分泌蛋白質(zhì)，從而輔助其定位功能提供特殊和集中性的治療。利用蛋白質(zhì)的不同功能，可以設(shè)計(jì)三種細(xì)菌治療的方法：控制細(xì)胞毒性，酶類藥物激活和活性分子分泌。利用細(xì)菌定位性，這三種方法可對(duì)給藥時(shí)間和位置進(jìn)行精密的控制，從而得到最佳治療效果，并將系統(tǒng)毒性降低到最小。一旦細(xì)菌定位在腫瘤環(huán)境中，它們就可以被激活產(chǎn)生能直接或間接治療疾病的化合物。

治療因素尤其是細(xì)胞毒性化合物的時(shí)序控制是必須的，因?yàn)樵谳斔椭聊[瘤的過(guò)程中基因表達(dá)的產(chǎn)物會(huì)擴(kuò)散至全身，毒害健康組織。利用無(wú)毒因子如射線或小分子誘導(dǎo)的基因啟動(dòng)子來(lái)控制表達(dá)可以克服這個(gè)問(wèn)題。射線照射可以有效啟動(dòng)基因表達(dá)，因?yàn)樯渚€易于穿透人體組織進(jìn)入腫瘤內(nèi)部特定位點(diǎn)。放射療法也是最常用的癌癥治療方法，這一方法已經(jīng)經(jīng)過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。在輻射誘發(fā)的recA啟動(dòng)子序列時(shí)序控制下，梭狀芽孢桿菌的某一經(jīng)基因修飾的菌株Clostridium可表達(dá)TNFα。與未經(jīng)射線照射的對(duì)照組相比，其TNFα的表達(dá)量提高了44％。該研究還發(fā)現(xiàn)在recA之下的基礎(chǔ)基因表達(dá)很重要，會(huì)影響這種方法的可控性，通過(guò)向啟動(dòng)子序列中插入放射敏感性基因可以很好的解決這一問(wèn)題。其他元素的添加能使基礎(chǔ)產(chǎn)物的水平降低30％。而將這些啟動(dòng)子與其他不同基因相結(jié)合，會(huì)獲得可控性更高的癌癥治療方法。

促進(jìn)基因表達(dá)的另外一種方式是由小分子激活啟動(dòng)子。L-阿拉伯糖對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織無(wú)害，已用于激活大腸桿菌PBAD啟動(dòng)子。在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入0.02％的L-阿拉伯糖，lux操縱子的表達(dá)量提高了105倍，但這一方法面臨的問(wèn)題是小分子可能因?yàn)閿U(kuò)散局限性而無(wú)法到達(dá)細(xì)菌菌落。然而，在以前的試驗(yàn)中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這個(gè)問(wèn)題，將小分子由靜脈注射15～30min后即可在腫瘤中檢測(cè)到。

控制給藥途徑的第二個(gè)機(jī)理是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行基因改造使其產(chǎn)生酶類，將無(wú)毒的藥物前體轉(zhuǎn)化為活性因子。沙門氏菌和梭狀芽孢桿菌已經(jīng)被設(shè)計(jì)用來(lái)表達(dá)胞嘧啶脫氨酶（CDase），從而將前體藥物中的5-氟胞嘧啶（5-FC）與化學(xué)療法的5-氟尿嘧啶（5-FU）分開(kāi)。CDase能催化5-FC脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU，5-FU被代謝為5-FUTP和5-FdUTP，前者能整合入RNA代替UTP，從而抑制tRNA和mRNA的合成，后者則可抑制胸苷酸合成酶，導(dǎo)致DNA合成障礙，它可從RNA和DNA分子水平來(lái)干擾細(xì)胞的存活，并且該底物能通過(guò)細(xì)胞間的縫隙連接進(jìn)行擴(kuò)散，引起臨近細(xì)胞死亡（即旁觀者效應(yīng)）［20］。在臨床試驗(yàn)中，注射過(guò)該重組沙門氏菌的病人瘤內(nèi)5-氟尿嘧啶的水平比血漿中提高了300％。梭狀芽孢桿菌的某些種屬經(jīng)改造后可表達(dá)硝基還原酶，將CB1954（5-乙烯亞氨基-2，4-二硝基苯）轉(zhuǎn)化為它的4-羥胺衍生物，而后者的毒性要比前者高10000倍。體外實(shí)驗(yàn)證明將藥物前體與細(xì)菌治療結(jié)合可促進(jìn)腫瘤退化。這一研究還表明通過(guò)重復(fù)增量也可以獲得腫瘤的連續(xù)退化。

細(xì)菌可以產(chǎn)生生理活性分子誘導(dǎo)生理反應(yīng)，這是其藥物輸送的第三個(gè)機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)梭狀芽胞桿菌經(jīng)改造后可以產(chǎn)生治療水平的白細(xì)胞介素-2［21］，從而引起T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤死亡。低氧誘導(dǎo)因子-1α是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)有利于細(xì)胞在低氧環(huán)境中生存的基因表達(dá)。目前已可用梭狀芽胞桿菌表達(dá)抗低氧誘導(dǎo)因子-1α的抗體片段，當(dāng)它與定位因子聯(lián)合使用時(shí)，可以有效治療癌癥［22］。細(xì)菌也可用于輸送DNA［23-24］，在這個(gè)過(guò)程中，基因從細(xì)菌傳遞到癌細(xì)胞然后表達(dá)哺乳動(dòng)物的治療蛋白。已設(shè)計(jì)出含有內(nèi)皮他丁和凝血酶敏感素-1基因的沙門氏菌。這兩個(gè)基因的產(chǎn)物通過(guò)抑制血管發(fā)生而阻礙腫瘤生長(zhǎng)。在小鼠模型中，這兩種治療方法都能夠大大降低腫瘤生長(zhǎng)速度。

盡管實(shí)驗(yàn)證明細(xì)菌療法具有很大的優(yōu)越性，但是也存在許多的問(wèn)題，比如在臨床上這些細(xì)菌不能很好地定植人的腫瘤，外源基因在腫瘤內(nèi)表達(dá)量不夠或者非靶向表達(dá)等。這些問(wèn)題都需要進(jìn)一步的研究來(lái)解決。

4 總結(jié)與展望

癌癥難治療是因?yàn)槊}管系統(tǒng)較弱而限制了它對(duì)氧、營(yíng)養(yǎng)素和藥物的輸送。細(xì)菌療法的優(yōu)勢(shì)是可以利用優(yōu)先生長(zhǎng)和能動(dòng)的分子運(yùn)輸將藥物分子定位于瘤內(nèi)微環(huán)境。細(xì)菌抗癌研究的關(guān)鍵點(diǎn)是改造菌株，主要研究的兩個(gè)方向則是瘤內(nèi)定位和可控的給藥途徑。先前梭狀芽胞桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的研究已證明某些細(xì)胞毒素、藥物前體活化酶和生物活性分子的表達(dá)可以被控制。定位和輸送系統(tǒng)的強(qiáng)度是互補(bǔ)的，當(dāng)將兩者結(jié)合時(shí)，可使藥物到達(dá)所有的腫瘤和轉(zhuǎn)移灶區(qū)域，并有效的殺死所有的癌細(xì)胞。將幾種表達(dá)不同藥物的細(xì)菌聯(lián)合使用，有可能大大提高治療的可控性和有效性。隨著技術(shù)的進(jìn)步，細(xì)菌療法有望成為對(duì)抗人類腫瘤的強(qiáng)大工具，為癌癥病人帶來(lái)福音。

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