GB/T 8538－2008 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法 存在的微生物學(xué)問題

馬群飛 林 堅(jiān)

福建省疾病預(yù)防控制中心

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2008年12月29日公布的GB/T 8538－2008《飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（以下簡稱新國標(biāo)），于2009年4月1日起正式實(shí)施。新國標(biāo)實(shí)施一年后，我們根據(jù)連續(xù)多年監(jiān)測飲用天然礦泉水水源及其瓶裝產(chǎn)品的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用情況，對新國標(biāo)中存在的微生物學(xué)問題進(jìn)行探討，完善、增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)的可操作性，并為新國標(biāo)的再次修訂提供參考依據(jù)。

總則

在新國標(biāo)4.1.7規(guī)定“計(jì)算結(jié)果除色度、渾濁度以兩位有效數(shù)字表示外，其他指標(biāo)均以三位有效數(shù)字表示。”不僅對微生物學(xué)檢驗(yàn)來說，即使是其他的理化檢驗(yàn)，這樣規(guī)定也是不切合實(shí)際的。實(shí)際上，在新國標(biāo)中，多處都出現(xiàn)了不符合這個(gè)規(guī)定的書寫方式。新國標(biāo)4.1.8檢驗(yàn)方法的選擇規(guī)定，“同一個(gè)項(xiàng)目如果有兩個(gè)或兩個(gè)以上的檢驗(yàn)方法時(shí)，可根據(jù)設(shè)備及技術(shù)條件選擇使用，但第一法為仲裁法。”在新國標(biāo)4.52大腸菌群檢驗(yàn)方法中，第一法多管發(fā)酵法是估計(jì)概率方法，可信度不高。從檢驗(yàn)精度來說，第一法最低檢出限為2 MPN/100mL（除標(biāo)準(zhǔn)制定者憑空想象的0 MPN/100mL外），無法滿足GB 8537－2008《飲用天然礦泉水》對于大腸菌群定量的要求（主要限量值分別為0、1、2 MPN/100mL），只有第二法濾膜法（直接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法）才可以報(bào)告這樣的精度。因此，只有第二法才可以作為仲裁方法。在強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.1－2010《國家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》也是明確“食品微生物檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)中對同一檢驗(yàn)項(xiàng)目有兩個(gè)及兩個(gè)以上定量檢驗(yàn)方法時(shí)，應(yīng)以平板計(jì)數(shù)法為基準(zhǔn)方法”?？紤]到礦泉水的包裝產(chǎn)品屬于食品的飲料類別，按照《中華人民共和國食品安全法》的要求，應(yīng)執(zhí)行相應(yīng)的強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。所以，建議在日常工作中，應(yīng)慎重執(zhí)行新國標(biāo)4.1.8的規(guī)定，避免導(dǎo)致法律上的糾紛。另外，按照GB 19489－2008《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》，所有進(jìn)行致病微生物檢驗(yàn)的單位，必須建立二級生物安全實(shí)驗(yàn)室，相應(yīng)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)也都應(yīng)該按照此標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

采集和保存

新國標(biāo)表4規(guī)定，微生物學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目的采樣容器材質(zhì)為硼硅玻璃。在4.2.2.2.4要求最好采用具塞廣口瓶。在實(shí)際工作中我們發(fā)現(xiàn)，加熱滅菌很容易導(dǎo)致具塞玻璃廣口瓶的瓶口破裂，損耗率非常大。建議使用耐高壓的聚乙烯或者聚丙烯塑料材質(zhì)的具塞廣口瓶。標(biāo)準(zhǔn)沒有對水源的微生物學(xué)采樣方法進(jìn)行要求。目前，監(jiān)督抽樣和樣品檢驗(yàn)工作常常分別由不同的單位完成，如何正確進(jìn)行無菌采樣，更成為不可忽略的問題，標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)對此明確規(guī)定。表4規(guī)定的微生物學(xué)測定項(xiàng)目為“菌落總數(shù)、大腸菌群”，與標(biāo)準(zhǔn)后續(xù)的檢驗(yàn)項(xiàng)目完全不配套，是一個(gè)典型的疏忽。采樣數(shù)量使用“體積/mL”表示，也不符合國家標(biāo)準(zhǔn)的書寫規(guī)定，建議書寫為“體積/（mL）”。表4規(guī)定微生物學(xué)測定采集500mL水樣，也無法滿足后續(xù)檢驗(yàn)方法的要求。因?yàn)閱螁芜M(jìn)行一次的四項(xiàng)微生物學(xué)指標(biāo)檢驗(yàn)，至少需要600mL（50＋250＋250＋50）水樣，更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足可能進(jìn)行的第二次檢驗(yàn)的樣品需要量。對于樣品保藏處理技術(shù)，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了6h的冷藏保存時(shí)間。但是在GB/T 5750.2－2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集與保存》中，規(guī)定0～4 ℃冷藏保存時(shí)間為4h，兩個(gè)相近的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定差距明顯。另外，表4規(guī)定的冷藏溫度為2 ℃～5 ℃，而后續(xù)的微生物學(xué)檢驗(yàn)使用的儀器要求使用0 ℃～8 ℃冰箱，冷藏保存的培養(yǎng)基則要求2 ℃～8 ℃保存，對于溫度控制的描述顯得過于隨意。

大腸菌群

新國標(biāo)沿用了GB/T 8538－1995的多管發(fā)酵法和濾膜法，未加修改，所以仍然存在原標(biāo)準(zhǔn)的一些缺陷，如未說明MPN（Most Probable Number，最可能數(shù)）的含義、多管發(fā)酵全陰性結(jié)果時(shí)以0 MPN/100mL作為結(jié)果直接報(bào)告偏差過大、濾膜法未設(shè)定平行檢驗(yàn)或質(zhì)量控制要求等。圖10最后缺少了一個(gè)進(jìn)行“MPN計(jì)數(shù)報(bào)告”的流程框圖。鑒于第一法檢驗(yàn)靈敏度無法滿足實(shí)際工作的要求，操作程序也比較繁瑣，可考慮采用定性檢驗(yàn)方法，直接在100mL雙料乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入100mL水樣，根據(jù)是否發(fā)酵產(chǎn)氣來判斷，最為經(jīng)濟(jì)省事。另外，在表32應(yīng)該增加備注，明確當(dāng)出現(xiàn)005、055這樣的結(jié)果時(shí)，該如何核查實(shí)驗(yàn)過程。畢竟這些異常數(shù)值的出現(xiàn)，不應(yīng)該直接作為最終的結(jié)果報(bào)告。在4.52.2.5.3應(yīng)明確在培養(yǎng)后“觀察濾膜上面的菌落特征。”在4.52.2.5.5之前應(yīng)明確 “挑取不少于3個(gè)（不足3個(gè)則全挑）可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察”，否則前后文句不對應(yīng)。計(jì)算公式（115）建議修改為“確證的大腸菌群菌落數(shù)（CFU）×100÷過濾的樣品量（mL）”。本標(biāo)準(zhǔn)其他的檢驗(yàn)項(xiàng)目都附加了質(zhì)量控制的要求，建議在大腸菌群的檢驗(yàn)中，也附加相應(yīng)的內(nèi)容。

糞鏈球菌

新國標(biāo)4.53.2原理中對于確證實(shí)驗(yàn)，漏掉了對于膽汁液態(tài)培養(yǎng)基生長的要求。實(shí)際上，新國標(biāo)微生物學(xué)檢驗(yàn)部分的原理描述完全是步驟的敘述，沒有真正描述檢驗(yàn)原理。4.53.5.2.3中未明確應(yīng)該如何挑選可疑菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)。建議描述為“挑取不少于5個(gè)（不足5個(gè)則全挑）可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，糞鏈球菌應(yīng)為革蘭氏染色陽性球菌，常排列成短鏈狀。根據(jù)菌落特征符合情況計(jì)數(shù)每250mL水樣中的典型菌落數(shù)”。4.53.5.3.2的過氧化氫酶試驗(yàn)應(yīng)該描述為“加幾滴3%過氧化氫溶液到載玻片的涂抹菌苔上，”因?yàn)槭褂谩熬骸眮砻枋觥熬Α辈磺‘?dāng)。4.53.5.3.3的膽汁液態(tài)培養(yǎng)基使用無菌的100g/L牛膽液，不符合實(shí)際工作的需要，建議修改為“100 g/L牛膽鹽溶液”。4.53.5.3.4中要求“若菌落能夠生長繁殖 ”，因?yàn)槭褂玫亩际且簯B(tài)培養(yǎng)基，不可能出現(xiàn)菌落，所以建議刪除“菌落”兩字。4.53.7質(zhì)量保證（包括其他致病菌項(xiàng)目）使用了大腸埃希氏菌ATCC 25922作為陰性對照菌株，從實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的要求來說，應(yīng)該使用生化特性接近的非特異性菌株。對于糞鏈球菌Fecal streptococcus的英文名稱，不能當(dāng)作拉丁文學(xué)名排成斜體，標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該直接使用拉丁文學(xué)名Enterococcus faecalis這樣規(guī)范的書寫方式。

銅綠假單胞菌

新國標(biāo)4.54.2原理最后“經(jīng)證實(shí)為銅綠假單胞菌，則其檢測結(jié)果為陽性”這句話，屬于典型的因果關(guān)系倒置，建議描述為“檢測結(jié)果均為陽性者，確證為銅綠假單胞菌。”對于乙酰胺利用試驗(yàn)采用“乙酰胺肉湯”，實(shí)際上該培養(yǎng)基不能稱為肉湯，建議稱為乙酰胺液體培養(yǎng)基或者乙酰胺利用培養(yǎng)基。該試驗(yàn)還要求使用含汞的鈉氏試劑，增加了實(shí)驗(yàn)室廢物排放的負(fù)擔(dān)。對于乙酰胺利用試驗(yàn)，多種產(chǎn)品的檢驗(yàn)方法國家標(biāo)準(zhǔn)都有很好的替代手段，可以考慮等效采用。從滿足實(shí)驗(yàn)需要并保護(hù)操作者健康角度考慮，對于紫外燈的功率，應(yīng)建議限制在8w以下。在圖12檢驗(yàn)程序里，產(chǎn)熒光（非藍(lán)/綠色）菌落和紅褐色菌落的框格下面，建議分別增加一個(gè)向下的箭頭，否則看不清檢驗(yàn)流程。因?yàn)?.54.5.4結(jié)果觀察、4.54.5.5確證性試驗(yàn)和4.54.5.6計(jì)數(shù)的操作順序前后交叉，多種專業(yè)術(shù)語描述混亂，建議合并?！皩⑵渌屑t褐色不發(fā)熒光的菌落進(jìn)行氧化酶測試、乙酰胺肉湯、金氏B培養(yǎng)基確證性試驗(yàn)，培養(yǎng)20 h～24 h觀察結(jié)果，防止因?yàn)榕囵B(yǎng)40 h～48 h導(dǎo)致菌落過分生長而出現(xiàn)菌落融合?！边@樣的描述明顯不準(zhǔn)確。建議從這里開始修改為“挑取其他所有不發(fā)熒光的菌落劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)20 h～24 h，進(jìn)行氧化酶、乙酰胺利用、金氏B培養(yǎng)基產(chǎn)生熒光試驗(yàn)”，之后分別描述各確證性試驗(yàn)的操作方法，最后按照公式（116）進(jìn)行計(jì)算。這樣的修改，可以避免漏檢那些完全沒有色素產(chǎn)生的目標(biāo)菌。4.54.5.6中“注：最初濾膜上顯熒光的菌落經(jīng)氧化酶反應(yīng)均呈陽性，因此不需在這個(gè)測試中計(jì)數(shù)（見表35）。”建議整句刪除，因?yàn)樾聡鴺?biāo)里不存在表35，而這句話也是前言不搭后語。4.54.6“計(jì)算菌落數(shù)時(shí)應(yīng)考慮到驗(yàn)證試驗(yàn)的比例及特定的水量，如礦泉水、泉水和其他瓶裝水 ”，也屬于病句，而且本標(biāo)準(zhǔn)不需要考慮除礦泉水之外的其他泉水和其他瓶裝水，建議修改為“計(jì)算菌落數(shù)時(shí)應(yīng)考慮驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果及過濾的水量”。公式（116）中F應(yīng)表達(dá)為“產(chǎn)生熒光的非藍(lán)綠色菌落數(shù)”，如果沒有排除藍(lán)綠色菌落，很可能將導(dǎo)致結(jié)果偏高。建議在4.54.9質(zhì)量保證中增加生化特性接近的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）作為非特異性菌株。

產(chǎn)氣莢膜梭菌

新國標(biāo)4.55.3.1要求配制庖肉培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基在標(biāo)準(zhǔn)全文中沒有用到，建議刪除。4.55.3.6.2和4.55.3.9.1中描述“本培養(yǎng)基應(yīng)新鮮設(shè)備”、“對氨基酸苯磺酸”，明顯屬于筆誤，應(yīng)該是新鮮制備和對氨基苯磺酸。對于“校正pH＝7.4”之類的描述，因?yàn)榕c其他微生物學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目不統(tǒng)一，建議刪除所有的“＝”。這個(gè)方法的最大疑惑在于其他微生物學(xué)檢驗(yàn)采用的濾膜孔徑都是0.45μm，而產(chǎn)氣莢膜梭菌是其中體型最粗大的微生物，卻要求使用0.22μm孔徑的濾膜，完全沒有必要。建議統(tǒng)一使用0.45μm孔徑的濾膜，有利于工作的開展。4.55.4.5要求配置的漩渦振蕩器全文沒有使用到，建議刪除。4.55.4.6規(guī)定使用常溫催化或堿性焦性沒食子酸除氧式來滿足厭氧培養(yǎng)需要，但是就我們的實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，這樣的簡易厭氧培養(yǎng)裝置，常常導(dǎo)致目標(biāo)菌無法形成真正黑色的菌落而漏檢。建議盡可能使用厭氧培養(yǎng)箱，如果使用簡易厭氧培養(yǎng)裝置，對于灰白色菌落也要進(jìn)行確證性試驗(yàn)，避免漏檢。4.55.6質(zhì)量保證也使用了大腸埃希氏菌作為陰性對照，應(yīng)該選擇生化特性接近的厭氧菌，才能真正滿足質(zhì)量控制的需要。

菌落總數(shù)

新國標(biāo)將菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法歸入資料性附錄B，但原理說明是經(jīng)培養(yǎng)后所得1mL水樣中所含“菌落”的總數(shù)，只包括一群嗜中溫的需氧的細(xì)菌菌落總數(shù)。應(yīng)該描述為“1mL水樣經(jīng)培養(yǎng)后，一群嗜中溫的需氧和兼性厭氧菌形成菌落的數(shù)量”。B.4.5.1.1“每次檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)作一平行接種，同時(shí)另用一個(gè)平皿只傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為空白對照”。按照質(zhì)量控制的慣例，空白對照肯定需要加入1ml稀釋液，而不能僅僅傾注營養(yǎng)瓊脂。建議實(shí)際操作中同時(shí)加入稀釋液作為空白。新國標(biāo)將培養(yǎng)時(shí)間從原來的24 h修改為48 h，但是前言沒有提及，導(dǎo)致不少基層單位在申報(bào)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定的標(biāo)準(zhǔn)變更時(shí)認(rèn)為“方法無變化”，而沒有進(jìn)行相應(yīng)的方法確認(rèn)工作。B.4.5.1.2又出現(xiàn)了“細(xì)菌總數(shù)”這個(gè)早已淘汰的術(shù)語，可能也是標(biāo)準(zhǔn)制定者的疏忽。在B.4.5.2.3要求“以下操作同生活飲用水的檢驗(yàn)步驟”，而新國標(biāo)沒有引用GB/T 5750.12－2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》，這樣的描述不符合國家標(biāo)準(zhǔn)的書寫規(guī)范。B.4.7.7要求“菌落數(shù)在100以內(nèi)按實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100時(shí)，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算?！边@樣的規(guī)定，不滿足實(shí)際工作的要求。當(dāng)平均菌落數(shù)在10以下，帶有小數(shù)點(diǎn)后面的數(shù)字時(shí)，肯定不能按照實(shí)有數(shù)報(bào)告。因此建議修改為“平均菌落數(shù)按照四舍五入方法，修約為整數(shù)報(bào)告。如修約后的數(shù)值超過兩位有效數(shù)字時(shí)，后面的數(shù)值用10的指數(shù)來表示?！痹诒鞡.1的例8報(bào)告方式中，要求報(bào)告為“＜1×10 CFU/mL”，這也是完全不符合常理的，也影響國家標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)肅性。