非小細(xì)胞肺癌患者血清CDH13基因甲基化檢測(cè)及意義

魯?shù)芦\ 劉偉 姬曉青 劉姝梅

聊城市人民醫(yī)院呼吸科，*中心實(shí)驗(yàn)室，山東 聊城 252000

肺癌是全世界范圍內(nèi)首位腫瘤死因。由啟動(dòng)子異常甲基化造成的特定基因的沉默在肺癌發(fā)病機(jī)制中起重要作用。鈣黏附素(cadherin)是調(diào)整上皮表型和腫瘤侵襲力的細(xì)胞黏附分子［1］。CDH13是cadherin家族的成員之一，是一個(gè)候選抑癌基因，在人類多種腫瘤中因啟動(dòng)子甲基化而沉默。在前列腺癌［2］、睪丸生殖細(xì)胞腫瘤［3］等的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者支氣管灌洗液中的研究表明，CDH13腫瘤特異性甲基化可能是NSCLC的一個(gè)早期診斷有價(jià)值的標(biāo)記［4］。鮮有肺癌患者血清中 CDH13甲基化的研究。甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)是一種應(yīng)用最廣泛的測(cè)定甲基化水平的方法。MSP只需要少量的DNA，可檢測(cè)出給定的CpG島0.1%的等位基因甲基化［5］。本研究采用MSP法檢測(cè)NSCLC患者外周血清中CDH13基因的甲基化狀態(tài)，分析其與臨床病理之間的相關(guān)性，探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

2007年9月5日—2008年12月20日本院呼吸內(nèi)科住院治療的62例NSCLC患者為研究對(duì)象，其中男性40例，女性22例；年齡42～75歲，中位年齡62歲。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)，其中鱗癌27例，腺癌35例，均未行放化療。TNM分期［6］：Ⅰ期1例，Ⅱ期10例，Ⅲ期24例，Ⅳ期27例。肺部良性疾病患者系我院呼吸內(nèi)科同期住院治療的30例患者，男性18例，女性12例；年齡45～74歲，中位年齡59歲；其中肺部感染8例，慢性阻塞性肺疾病15例，氣胸7例。16名健康志愿者為我院體檢中心體檢者。男性10例，女性6例；年齡46～68歲，中位年齡59歲。3組性別(χ2=0.18，P>0.05)和年齡(方差分析，F(xiàn)=1.05，P>0.05)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

所有患者均于確診后、手術(shù)或放化療前凌晨空腹采集外周靜脈血5 mL，健康體檢者血液標(biāo)本由我院體檢中心提供。標(biāo)本4 ℃靜置2 h，3 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，留取血清，將血清標(biāo)本置-80 ℃保存。

1.2.2 血清DNA提取

采用QIAamp Blood Mini Kit DNA抽提試劑盒(QIAGEN公司，德國)提取血清DNA。每份標(biāo)本使用2 mL血清，按照說明成比例地增大所需的反應(yīng)試劑用量，多次過離心柱，最后以50μL滅菌去離子水洗脫DNA，-80 ℃保存。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾

參照Zinn等［7］的方法，對(duì)所提取的血清DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)。

1.2.4 DNA純化及脫磺基反應(yīng)

在提取所得的DNA中，加入1 μg鮭魚精DNA(Sigma公司產(chǎn)品)作為載體，以終濃度為0.3 mol/L的NaOH于40 ℃反應(yīng)15 min變性解鏈，依次加入新鮮配制的對(duì)苯二酚(Sigma公司產(chǎn)品)30 μL和pH為5.0的NaHSO3(Sigma公司產(chǎn)品)520 μL，輕柔混勻，以石蠟油覆蓋，55 ℃避光反應(yīng)14 h。吸除石蠟油，采用美國 Promega公司生產(chǎn)的Wizard DNA Clean-Up System 提純DNA，以終濃度為0.3 mol/L的NaOH于室溫處理10 min脫硫，最后冷乙醇沉淀，所得DNA 溶于30μL滅菌去離子水中，-80 ℃保存。

1.2.5 甲基化特異性PCR

參照文獻(xiàn)［8］設(shè)計(jì)CDH13引物，分別識(shí)別甲基化特異性(M)和非甲基化特異性序列(U)。CDH13具體序列，M正義引物：5’-TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC-3’，M反義引物：5’-GACGTTTTCATTCATACACGCG-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物大小：243 bp。U正義引物：5’-TTGTGGGGTTGTTTTTTGT-3’，U反義引物：5’-AACTTTTCATTCATACACACA-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物大?。?43 bp。

PCR反應(yīng)體系20 μL，其中去離子水14.95 μL，10×PCR緩沖液2 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.2 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.25 μL，上下游引物各0.2 μL(25 pmol)，修飾后的DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶(10 U/μL)0.2μL，充分混勻后置DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、64 ℃(甲基化)、56 °C(非甲基化)退火30 s、72 ℃延伸30 s，共44個(gè)循環(huán)，最后72 ℃終延伸5 min［9］。

取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL行2%的瓊脂糖凝膠電泳(10 V/CM，20 min)，溴化乙啶染色后凝膠成像系統(tǒng)拍照。以正常人外周血淋巴細(xì)胞DNA作為非甲基化陽性對(duì)照，過量CpG(Sss Ⅰ)甲基化酶(美國NEB公司產(chǎn)品)修飾的淋巴細(xì)胞DNA作為甲基化陽性對(duì)照，水空白代替DNA作為陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

定量資料采用t檢驗(yàn)，分類資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在SPSS 12.0版軟件包上完成。

2 結(jié) 果

2.1 血清CDH13基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)結(jié)果

62例NSCLC患者中，有23例患者血清DNA CDH13基因甲基啟動(dòng)子區(qū)域CpG島發(fā)生了甲基化，檢出率為37.1%，而良性肺部疾病患者和健康體檢者血清未檢出CDH13基因甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.84，P<0.01，圖1)。

2.2 CDH13基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理的相關(guān)性

NSCLC患者血清CDH13基因甲基化狀態(tài)與性別、年齡、病理類型和吸煙狀況無明顯相關(guān)(P>0.05)。CDH13甲基化率在TNM Ⅲ～Ⅳ期(43.14%，22/51)高于Ⅰ～Ⅱ期(9.10%，1/11)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.14，P>0.05)，低、未分化組顯著高于高、中分化組(χ2=4.72，P<0.05，表1)。

圖1 NSCLC患者血清CDH13基因甲基化檢測(cè)電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of CDH13 gene methylation in serum of NSCLC patients

3 討 論

DNA甲基化是基因修飾的重要方式，真核生物DNA的甲基化位點(diǎn)主要是CpG島中的胞嘧啶(C)。在腫瘤中，盡管全局上呈現(xiàn)低甲基化，但是在CpG島區(qū)域基因組是高甲基化的，且常常與啟動(dòng)子相關(guān)。CpG島區(qū)域啟動(dòng)子甲基化是腫瘤相關(guān)抑癌基因的一種主要的失活機(jī)制［10］，與一些腫瘤的演變直接相關(guān)。

Cadherin家族是一組鈣依賴性糖蛋白，廣泛分布于各種類型的細(xì)胞表面，和腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CDH13是cadherin家族中的一個(gè)非典型成員，缺少跨膜區(qū)域，通過甘油磷酸肌醇位點(diǎn)錨定于細(xì)胞膜的外表面，主要利用其信號(hào)蛋白影響分子行為，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)常常下調(diào)。CDH13基因位于人染色體16q24.2-3，在肺癌和乳腺癌中，其異常甲基化伴隨基因表達(dá)缺失［11］。在諸如肺癌、卵巢癌、宮頸癌和前列腺癌等不同腫瘤中CDH13表達(dá)下調(diào)與不良預(yù)后有關(guān)。CDH13在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞株中重新表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲力，增加對(duì)凋亡的易感性，在體內(nèi)減慢腫瘤生長［12］。CDH13表達(dá)缺失在NSCLC中經(jīng)常出現(xiàn)，有助于腫瘤的局部生長和種植［13］。CDH13在不同腫瘤中常常因啟動(dòng)子甲基化而失活，啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化是導(dǎo)致 CDH13基因失活的主要機(jī)制。

表1 CDH13基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between promoter methylation status of CDH13 and clinicopathologic features

研究表明，腫瘤患者外周血中存在一定數(shù)量的DNA，并且含量遠(yuǎn)高于正常人，可能來源于腫瘤細(xì)胞壞死釋放［14］。從外周血中提取并且作為腫瘤DNA的代表，在腫瘤相關(guān)的分子生物學(xué)研究方面開啟了一個(gè)新的領(lǐng)域。血清易于取得，因此是理想的DNA 甲基化檢測(cè)標(biāo)本。MSP法是一項(xiàng)應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)甲基化水平的技術(shù)，常規(guī)MSP的靈敏度可達(dá)1∶2 000。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清中CDH13基因甲基化檢出率為37.1%，提示CDH13基因甲基化在NSCLC患者血清中經(jīng)常出現(xiàn)，CDH13基因甲基化及隨之而來的CDH13表達(dá)缺失是NSCLC的常見事件。由于在肺部良性疾病患者和健康體檢者外周血血清中未檢測(cè)到CDH13基因啟動(dòng)子甲基化，因此，NSCLC患者外周血清中CDH13基因啟動(dòng)子甲基化具有腫瘤特異性。CDH13甲基化作為一個(gè)新的NSCLC腫瘤標(biāo)記，有望成為啟動(dòng)子甲基化框架內(nèi)有價(jià)值的篩選NSCLC的標(biāo)志。

既往利用NSCLC切除標(biāo)本檢測(cè)CDH13甲基化狀況的研究報(bào)道，腫瘤組織中CDH13甲基化率為29.5%～66%［1,15］，均高于本研究結(jié)果，可能與組織中DNA數(shù)量大于血液有關(guān)。Ulivi等［16］檢測(cè)NSCLC患者血清中CDH13基因甲基化率為23%，低于本研究結(jié)果，可能與病例選擇和(或)種族差異有關(guān)。Hsu等［17］研究顯示，肺癌組織與相應(yīng)血清DNA中CDH13基因甲基化檢測(cè)結(jié)果是一致的。Rykova等［18］認(rèn)為，血清中CDH13甲基化檢測(cè)可以用于肺癌的早期診斷。采用外周血提取DNA研究目標(biāo)基因的甲基化狀況，方法基本無創(chuàng)，簡單易行，患者易于接受，如果能得到進(jìn)一步證實(shí)，那么外周血中基因甲基化的檢測(cè)有望成為肺癌早期診斷的重要輔助手段。

本研究進(jìn)一步比較了NSCLC患者血清CDH13基因甲基化檢出率與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清CDH13基因甲基化狀況與患者性別、年齡、病理類型和吸煙狀況無關(guān)，低、未分化組檢出率顯著高于高、中分化組，提示CDH13基因甲基化可能與NSCLC惡性程度有關(guān)。肺癌惡性程度高，侵襲力強(qiáng)，易于復(fù)發(fā)，患者生存期短。Kubo等［19］研究100例支氣管肺泡癌標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，CDH13 在侵襲性類型的甲基化率明顯高于非侵襲性類型。Brock等［20］發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期NSCLC外科手術(shù)切除患者CDH13啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化和早期復(fù)發(fā)有關(guān)。Yanagawa等［21］用MSP法檢測(cè)101例NSCLC腫瘤切除組織CDH13啟動(dòng)子甲基化狀況，和CDH13甲基化陰性組相比，陽性組患者生存期更短。癌細(xì)胞粘附力的降低是肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。啟動(dòng)子甲基化造成的CDH13表達(dá)下降，導(dǎo)致維持細(xì)胞間同質(zhì)型粘附的黏附分子表達(dá)下降，可能是NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因之一。Feng等［22］認(rèn)為，檢測(cè)CDH13在血液中的甲基化狀況可能用于NSCLC患者早期術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。雖然患者CDH13基因甲基化率在Ⅲ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Ulivi等［16］在肺癌組織和相應(yīng)血清中的研究結(jié)論相似。提示CDH13基因甲基化可能在NSCLC早期即已發(fā)生，在病情加重過程中持續(xù)存在并逐漸進(jìn)展。Kim等［23］研究305例NSCLC石蠟標(biāo)本CDH13甲基化狀況，其甲基化率為43%，并且與病理分期有關(guān)，病理分期越晚，陽性率越高。因此，CDH13甲基化可能和NSCLC進(jìn)展有關(guān)。眾所周知，吸煙是肺癌的危險(xiǎn)因素之一，也與DNA甲基化有關(guān)［24］。本研究中，CDH13甲基化組和非甲基化組吸煙指數(shù)無差異，尚無明確的解釋，可能與病例選擇有關(guān)，也可能系除吸煙以外的致癌因素誘導(dǎo)了分子變化而致。

總之，NSCLC患者外周血中CDH13基因的甲基化檢出率較高。CDH13基因異常甲基化可能在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，有望成為NSCLC輔助診斷分子標(biāo)記，CDH13也許能成為NSCLC的一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)。有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究評(píng)估。

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