日糧精氨酸水平對生長肉兔氮代謝及肝臟胰島素樣生長因子（IGF-I）基因表達(dá)的影響

精氨酸作為幼年家畜和家禽的必需氨基酸，具有重要的營養(yǎng)、代謝和免疫功能。近年來，精氨酸已經(jīng)成為許多科學(xué)家的研究熱點。越來越多的研究已經(jīng)表明，肝臟胰島素樣生長因子（IGF－I）在動物生長發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用。IGF既是GH發(fā)揮作用的最主要介導(dǎo)因子，又具有與GH無關(guān)的獨特作用。Wray－Cahen C D[1]研究表明，IGF是動物生長的直接調(diào)節(jié)物，可以刺激多種細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和結(jié)締組織及骨髓的產(chǎn)生。了解IGF的作用及其變化規(guī)律對于了解動物的生長及某些疾病的發(fā)生機(jī)理，運用各種(遺傳和營養(yǎng))手段實現(xiàn)對動物生長的調(diào)控，從而提高動物的健康和生產(chǎn)水平與效率具有重要的理論和實踐意義[2]。

本試驗以斷奶～2月齡生長肉兔為研究對象，在其他各種營養(yǎng)素滿足需要的情況下，探討添加不同精氨酸水平對氮代謝和肝臟細(xì)胞中IGF－I基因表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

體重基本一致的100只斷奶肉兔。試兔單籠飼養(yǎng)，試驗期間日喂食2次，采用常規(guī)飼養(yǎng)管理和免疫程序，自然采光、通風(fēng)。自由采食，自由飲水。

1.2 試驗日糧及試驗設(shè)計

基礎(chǔ)日糧（對照組）參照NRC(1977)家兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制而成。試驗日糧4組，在基礎(chǔ)日糧中以DL-精氨酸鹽酸鹽的形式添加精氨酸，添加量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，日糧加工成直徑約4～6 mm的顆粒飼料，儲存在通風(fēng)干燥避光處備用?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

100只試兔按照體重分為5組，每組20只，公母各半，各組間體重差異不顯著。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組分別飼喂以上4種日糧，預(yù)試期7 d，正式期23 d。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 氮代謝指標(biāo)的測定

飼養(yǎng)試驗階段結(jié)束前6 d，每組隨機(jī)抽取6只試驗兔轉(zhuǎn)移到經(jīng)消毒處理的代謝籠內(nèi)，單籠飼養(yǎng)，并飼喂相應(yīng)的試驗日糧，自由采食和飲水。預(yù)試期3 d，后3 d分別收集每只兔全天的糞樣和尿樣（每天上午8～9點，下午4～5點），4℃密封保存，連收3 d，同時記錄每只試驗兔每天的采食量、排糞量和排尿量。鮮糞稱重后，加10%的硫酸固氮，然后在烘箱中于 65℃下烘干 24 h，稱重即糞樣的風(fēng)干重，最后將3 d的風(fēng)干糞樣混合粉碎待測。尿樣量取后按一定的比例倒入已準(zhǔn)備好的250 ml塑料瓶中，加入5 ml濃硫酸固氮，每天取樣比例相同，混勻后冷凍保存?zhèn)溆?。樣品含氮量的測定依據(jù)《飼料分析及飼料檢測技術(shù)》（張麗英，2002）進(jìn)行測定。

可消化氮(DN)=食入氮(IN)－糞氮(FN)；

沉積氮(RN)=食入氮(IN)－糞氮(FN)－尿氮(UN)；

氮表觀消化率(DN/IN，%)=DN/IN×100；

食入氮轉(zhuǎn)化為沉積氮的效率(RN/IN，%)=RN/IN×100；

可消化氮利用率(RN/DN，%)=RN/DN×100。

1.4 肝臟樣品的采集與制備

在試驗開始后的第30 d早晨空腹稱重，每組隨機(jī)抽取6只試驗兔，以頸椎錯位法將其致死，屠宰，立刻取肝臟相對固定部位樣品，放入Eppendorf管中，每管約0.5 g，每組織6管重復(fù)，液氮速凍后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實驗方法

對家兔肝臟細(xì)胞中IGF-I基因的表達(dá)水平進(jìn)行了相對定量分析，采用SYBR GreenⅠ熒光染料嵌合法，以家兔肝臟樣品提取的Total RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別對管家基因（GAPDH）和目的基因（IGF-I）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對各樣品管家基因和目的基因分別進(jìn)行定量，通過管家基因的校正，檢測各樣品目的基因的相對表達(dá)量。

1.5.1 實驗試劑

TaKaRa SYBR PrimeScriptTM、RT-PCR Kit(Perfect Real Time)(TakaRa Code.DRR063A)；TaKaRa DNaseⅠ (Rnase Free)(TaKaRa Code.D2215)；TaKaRa RNAiso Reagent(TaKaRa Code.D312)；Easy Dilution(for Real Time PCR)TaKaRa Code.D9160；DNA Marker DL 2000(TaKaRa Code.D501)。

1.5.2 主要實驗儀器

TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(TakaRa Code.TP600)；TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice、Real Time System(TaKaRa Code.TP800)。

1.6 實驗步驟

1.6.1 RNA的提取

1.6.1.1 前處理

凡與RNA操作有關(guān)的玻璃器皿和剪刀、鑷子等器械經(jīng)常規(guī)洗滌烘干后，用錫箔紙包好，180℃烘烤8 h或200℃烘烤2～4 h。塑料制品用0.1%DEPC浸泡處理37℃2 h，或室溫處理過夜，再用滅菌雙蒸水漂洗數(shù)次，高壓消毒去除DEPC。(注：操作過程中用到的所有試劑必須用DEPC處理過的水配制)。

1.6.1.2 組織中總RNA的提取（Trizol法）

①取50～100mg組織研磨成粉末（在液氮中操作），轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中；

②加入1 ml Trizol，用力混勻至清澈，放置在冰上；

③4℃、12 000×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個1.5 ml離心管中；

④加入0.2 ml氯仿，用力搖動15 s，室溫放置2～3 min；

⑤4℃、12 000×g離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個1.5 ml離心管中；

⑥加入0.5 ml異丙醇，混勻，室溫放置30 min沉淀RNA；

⑦4 ℃、12 000×g離心 10 min，棄上清；

⑧加入1 ml 75%乙醇（DEPC水配制）洗滌RNA沉淀一次；

⑨4 ℃、7 500×g離心5 min，棄乙醇；

⑩真空干燥，加入 50～70 μl DEPC·H2O 溶解RNA；

?分裝，－70 ℃保存；

?RNA含量的測定 (比色法)：將提取的總RNA在紫外分光光度計260 nm和280 nm下測吸光度A值，并計算OD260/OD280的值。此值在1.7～2.0之間說明提取的RNA純度較高，適宜進(jìn)行下一步的實驗。

1.6.2 引物序列（見表2）

表2 引物序列信息

1.6.3 反應(yīng)組成及反應(yīng)條件

1.6.3.1 RT 反應(yīng)(見表3）

表3 RT反應(yīng)

1.6.3.2 PCR 反應(yīng)(見表4）

表4 PCR反應(yīng)

1.6.4 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取6個樣品的Total RNA（500 ng）反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，用EASY Dilution按8倍梯度稀釋（80、81、82、83、84倍）作為模板，分別制作管家基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。管家基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1～圖3；目的基因 IGF－I標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4～圖 6。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用SAS 8.0統(tǒng)計軟件中的GLM進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析，用Duncan's法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較。

2 結(jié)果與分析

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品GAPDH基因擴(kuò)增曲線

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品GAPDH基因熔解曲線

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品IGF－I基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品IGF－I基因擴(kuò)增曲線

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品IGF－I基因熔解曲線

2.1 日糧不同精氨酸水平對斷奶～2月齡肉兔氮代謝指標(biāo)的影響（見表5）

由表5可知，日糧中不同水平精氨酸對生長肉兔的尿氮水平影響顯著（P值為0.016 7），各添加組的尿氮含量顯著低于不添加組（P＜0.05）。日糧中不同水平精氨酸對生長肉兔的其它氮代謝指標(biāo)均無顯著影響（P＞0.05）。

2.2 產(chǎn)物特異性的確定（見圖7、圖8）

表5 日糧添加精氨酸對斷奶～2月齡生長肉兔氮代謝指標(biāo)的影響

圖7 樣品IGF－I基因熔解曲線

圖8 樣品GAPDH基因熔解曲線

由圖7和圖8樣品GAPDH和IGF－I的基因熔解曲線圖可以看出，目的基因和管家基因擴(kuò)增均有單一穩(wěn)定的峰，說明目的基因和管家基因引物特異性很好，得到了特異性產(chǎn)物。

2.3 擴(kuò)增曲線（見圖9～圖10）

圖9 樣品IGF－I基因擴(kuò)增曲線

圖10 樣品GAPDH基因擴(kuò)增曲線

2.4 精氨酸對斷奶～2月齡生長肉兔肝臟IGF－I mRNA表達(dá)量的影響(見表6)

由表6可知，日糧不同精氨酸水平顯著影響肝臟IGF－I mRNA 表達(dá)量（P值為 0.018 2），并且添加精氨酸組IGF－I mRNA表達(dá)量明顯高于不添加組（P＜0.05），各添加組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表6 精氨酸添加水平對斷奶～2月齡生長肉兔肝臟IGF－I mRNA表達(dá)量的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 日糧中添加不同精氨酸水平對斷奶～2月齡肉兔氮代謝的影響

肉兔食入飼料的含氮營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)體內(nèi)消化代謝，一部分合成體蛋白沉積體內(nèi)或被機(jī)體所利用，另一部分形成代謝廢棄產(chǎn)物隨糞、尿排出，構(gòu)成了家兔的氮平衡。糞N和尿N是食入N的兩個損失部分，糞N是經(jīng)過消化道而沒有吸收的部分，這部分N受飼料蛋白含量的影響較大（Spreadkury，1974），尿N是被吸收的氨基酸參加組織代謝，沒有被利用合成體蛋白而脫氨后由尿排出，這部分N受飼料氨基酸平衡的影響較大（Ahmed 等，1984）。

本試驗中各添加組的尿氮含量顯著低于不添加組，說明添加精氨酸能促進(jìn)尿氮的吸收。但本試驗添加精氨酸并未改變氮的沉積和表觀消化率等其它氮代謝指標(biāo)。

3.2 精氨酸對斷奶～2月齡生長肉兔肝臟IGF－I mRNA表達(dá)量的影響

肝臟是Arg代謝的主要部位，也是循環(huán)中IGF－I的主要來源。灌注的肝臟、培養(yǎng)的肝移植物和原代培養(yǎng)肝細(xì)胞均可釋放IGF－I，肝臟IGF－I mRNA的水平是其他組織的50到100倍。

因食物剝奪或限制引起營養(yǎng)不良時，會抑制肝臟IGF－I的基因表達(dá) (Straus 等，1990；Pell 等，1992；Weller等，1994)[3－5]，造成循環(huán) IGF－I水平降低。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量提高時，小鼠肝臟IGF－I mRNA的含量增加(Miura等，1992)[6]。采食無蛋白日糧或低蛋白日糧的小鼠體重減輕，肝臟IGF－I mRNA表達(dá)和循環(huán)IGF－I水平降低（Straus等，1990；Vandehaar等，1991)[3,7]，同樣，低蛋白日糧降低IGF－I mRNA表達(dá)和血清IGF－I水平的現(xiàn)象也出現(xiàn)在大動物如綿羊 (Pell等，1992)[4]中。

本試驗研究表明，日糧添加精氨酸能提高斷奶～2月齡生長肉兔肝臟IGF－I mRNA的表達(dá)量，說明精氨酸可能通過生長軸來提高IGF－I mRNA的水平，從而達(dá)到促進(jìn)動物生長的目的。

[1]Wray－Cahen C D,Kerry D E,Evock Clover C M,et al.Redefining by composition:nutrients,hormones,and geese in meat production[J].Ann.Rev.Nutr.,1998,18:63－92.

[2]張克英,陳代文.類胰島素樣生長因子及其營養(yǎng)調(diào)控[J].中國畜牧雜志，2002，38（6）：42－44.

[3]Straus D S,Takemoto C D.Effect of dietary protein deprivation on insulin－like growth factor(IGF)－I and －II,IGF binding protein－2,and serum albumin gene expression in rat[J].J.Endocrinol.,1990,127:1849－1860.

[4]Pell J M,Bates P C.Differential actions of growth hormone and insulin－ like growth factor－I on tissue protein metabolism in dwarf mice[J].J.Endocrinol.,1992,130:1942－1950.

[5]Weller P A,Dauncey M J,Bates P C,et al.Regulation of porcine insulin－like growth factor I and growth hormone receptor mRNA expression by energy status[J].Am.J.Physiol.,1994,266(5):776－785.

[6]Miura Y,Kato H,Noguchi T.Effect of dietary proteins on insulinlike growth factor－I(IGF－I)messenger ribonucleic acid content in rat liver[J].Br.J.Nutr.,1992,67:257－265.

[7]VandeHaar M J,Moats Staats B M,Davenport M L,et al.Reduced serum concentrations of insulin－like growth factor－I(IGF－I)in protein－restricted growing rats are accompanied by reduced IGFImRNA levels in liver and skeletal muscle[J].J.Endocrinol.,1991,130:305－312.