地黃蘇合香合劑對(duì)早期肝性腦病大鼠腦內(nèi)外周型苯二氮受體的影響

劉赫，劉雁勇，楊楠，紀(jì)超，左萍萍，龔韜，廖磊，侯曉明，蔡哲

肝性腦病(hepatic encephalopathy,HE)是指發(fā)生于肝臟功能?chē)?yán)重障礙引起的以代謝紊亂為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)綜合征。發(fā)病初期以自主活動(dòng)減少、定向力障礙為主；繼而產(chǎn)生神經(jīng)精神癥狀，如性格改變、行為異常等[1]。它是慢性肝病及嚴(yán)重肝病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥和死亡原因，病死率高達(dá)60%～80%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。外周型苯二氮受體(peripheral-type benzodiazepine receptors,PBRs)與中樞γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)相關(guān)的苯二氮受體不同，位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體膜上。在肝硬化伴肝性腦病患者腦內(nèi)PBRs增加，并有實(shí)驗(yàn)證明其增加可能是慢性高氨血癥的結(jié)果[2]。PBRs的作用受到安定結(jié)合抑制劑(diazepam binding inhibitor,DBI)的調(diào)節(jié)，后者是星形膠質(zhì)細(xì)胞中的一種內(nèi)源性神經(jīng)肽。DBI作用于PBRs后刺激神經(jīng)激素產(chǎn)生，并能擴(kuò)大GABA的作用。在肝性腦病的動(dòng)物模型中，無(wú)論是DBI成分還是PBRs的密度均有增加[3]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，選擇地黃和蘇合香兩味藥組成的“地蘇合劑”，采用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)大鼠早期肝性腦病模型，通過(guò)放射性配基受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，得到PBRs的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以此探討中藥對(duì)化學(xué)性肝損傷誘導(dǎo)的肝性腦病早期的防治作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2007-0001。飼養(yǎng)條件：分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食、飲水，自然晝夜節(jié)律光照，室溫22℃～25℃，相對(duì)濕度40%～60%。在適應(yīng)環(huán)境1周后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組6只。

1.2 藥品、試劑與儀器 本實(shí)驗(yàn)采用的“地蘇合劑”含地黃提取物(水蘇糖含量49.88%，梓醇含量2.56%)及蘇合香，均由北京市中藥研究所中藥化學(xué)室提供；乳果糖(杜秘克)：規(guī)格：15 ml/袋，含乳果糖10 g，蘇威制藥有限公司，批號(hào)：335202；CCl4：北京市化學(xué)試劑公司，批號(hào)：20090119，實(shí)驗(yàn)前用滅菌的橄欖油配成50%濃度。[3H]PK11195：放射性比活度83.5 Ci/mmol,PerkinElmer Life Science Co.,USA，非標(biāo)記PK11195：Sigma Chemical Co.,USA，閃爍液以及1450LSC&液體閃爍技術(shù)儀：PerkinElmer Life Science Co.,USA。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備及給藥 除對(duì)照組外，其余組采用經(jīng)典的CCl4誘發(fā)肝纖維化模型，即灌胃給予50%CCl41 ml/kg，每周2次，連續(xù)造模12周[4]。在造模的同時(shí)，陽(yáng)性藥組給予乳果糖6 g/kg，低劑量組給予地黃提取物0.5 g/kg+蘇合香0.008 g/kg，中劑量組給予地黃提取物1 g/kg+蘇合香0.016 g/kg，高劑量組給予地黃提取物2 g/kg+蘇合香0.032 g/kg。

1.3.2 皮層線粒體制備 造模12周結(jié)束后，每組取部分大鼠斷頭，迅速剝離顱骨，分離出皮層，每只大鼠取1/4腦皮層按1∶9的比例投入冰冷的pH 7.4勻漿緩沖液中冰浴電動(dòng)勻漿。每組動(dòng)物的勻漿液混合至一管，于4℃，700 g離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈離心管，4℃，16000 g離心10 min。收集沉淀，加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液8 ml重新懸浮沉淀，4℃，12000 g離心30 min，洗滌沉淀2次，收集沉淀物即線粒體。

1.3.3 放射配基受體結(jié)合飽和實(shí)驗(yàn) 取線粒體于4℃下解凍，加入預(yù)冷的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液電動(dòng)勻漿，調(diào)整每管蛋白質(zhì)濃度約為0.5～1.5 mg/ml。每管反應(yīng)體系總體積均為 300μl，其中膜懸液 100μl。非特異結(jié)合管中加入100μl非標(biāo)記PK11195。每管均加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液補(bǔ)足總反應(yīng)體積。4℃孵育10 min 后，每管加入 10μl[3H]PK11195，在 0.1～3.5 nmol/L范圍內(nèi)設(shè)置7個(gè)濃度梯度。每個(gè)樣本均為平行3管，4℃孵育1 h后，迅速真空抽濾到玻璃纖維素濾膜上，用20 ml預(yù)冷的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液重復(fù)洗滌濾膜兩次終止反應(yīng)。濾膜移至干凈管中，加入2 ml甲苯閃爍液。暗適應(yīng)至少8 h以減少化學(xué)發(fā)光，于液閃儀上測(cè)其每分鐘計(jì)數(shù)值(counts per minute,cpm)值，每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)30 s。為計(jì)算解離平衡常數(shù)(Kd)值和最大結(jié)合容量(Bmax)值，采用Scatchard方法作圖進(jìn)行直線回歸，直線斜率為-1/Kd，橫軸截距為Bmax。

2 結(jié)果

通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)和血氨等指標(biāo)的檢測(cè)，可以判定早期肝性腦病模型成功建立[4]。

放射性配基受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，大鼠腦皮層線粒體結(jié)合活性見(jiàn)表1。模型組大鼠腦皮層線粒體PBRs結(jié)合活性較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，陽(yáng)性藥組大鼠腦皮層線粒體PBRs結(jié)合活性較模型組明顯降低(P＜0.01)，中、高劑量組大鼠腦皮層線粒體PBRs結(jié)合活性較模型組降低(P＜0.05)。

在受體飽和實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠腦皮層線粒體PBRs Kd值無(wú)顯著性學(xué)差異(P＞0.05)。模型組大鼠腦皮層線粒體PBRs的Bmax值較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，陽(yáng)性藥組和高劑量組大鼠Bmax值較模型組明顯降低(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠腦皮層線粒體結(jié)合活性(fmol/mg prot.)

表2 各組大鼠腦皮層線粒體PBRs受體飽和實(shí)驗(yàn)

3 討論

肝性腦病是各種急、慢性肝衰的神經(jīng)精神系統(tǒng)并發(fā)癥，癥狀多種多樣，其發(fā)生的確切機(jī)制尚未完全明了，不過(guò)，氨中毒學(xué)說(shuō)已被廣泛接受。已有報(bào)道，在實(shí)驗(yàn)性急性肝衰竭中，氨刺激PBRsmRNA和PBRs結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)增加。同樣，暴露于氨或錳的星形膠質(zhì)細(xì)胞PBRs結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)也增加，提示血氨增高和(或)錳沉積可能是PBRs結(jié)合位點(diǎn)增加的原因[5-10]。PBRs激活后能誘導(dǎo)某些神經(jīng)類(lèi)固醇的合成[11]，神經(jīng)性類(lèi)固醇合成的增加在肝性腦病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的PBRs主要存在于外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有組織的線粒體膜上[12]，并主要集中在線粒體內(nèi)膜與外膜相接觸的部位，即線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔[13]，參與調(diào)控神經(jīng)類(lèi)固醇的合成以及神經(jīng)元的凋亡過(guò)程[14-17]。最近的研究表明，PBRs在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)變性、腫瘤、炎癥、脫髓鞘、腦缺血、腦創(chuàng)傷、癲癇和肝性腦病中表達(dá)明顯上調(diào)。因此PBRs已成為反映體內(nèi)外神經(jīng)病理學(xué)改變的一種敏感而特異的定量指標(biāo)。深入研究其作用機(jī)制具有重要理論意義和實(shí)際意義。

線粒體PBRs具有廣泛的生物學(xué)功能，它與激素產(chǎn)生的調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的調(diào)節(jié)、凋亡的發(fā)生、線粒體膜電位的調(diào)控、線粒體呼吸功能的調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)的反應(yīng)、電壓敏感型鈣通道的調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、腫瘤細(xì)胞的分化均密切相關(guān)[18]。在體內(nèi)，PBRs主要通過(guò)與其特異性配體結(jié)合而發(fā)揮多種生理功能。它可促進(jìn)膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入磷脂膜，從而促進(jìn)髓鞘形成；細(xì)胞因子通過(guò)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞PBRs的表達(dá)來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕的形成，提示PBRs參與神經(jīng)修復(fù)過(guò)程。PBRs表達(dá)增加能夠很好地反映局灶性腦缺血半暗帶以及損傷神經(jīng)元通路順行和逆行遠(yuǎn)隔區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞增生和活化。當(dāng)持續(xù)異常的信號(hào)輸入導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)長(zhǎng)期改變時(shí)，經(jīng)突觸傳遞的區(qū)域也出現(xiàn)膠質(zhì)活化反應(yīng)。因此，PBRs表達(dá)增加不僅是對(duì)組織損傷的反應(yīng)，而且是對(duì)疾病的適應(yīng)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建過(guò)程的標(biāo)志[19-20]。在線粒體PBRs的功能中，與甾體類(lèi)激素合成的關(guān)系是最為人們所熟識(shí)的，膽固醇從線粒體膜外轉(zhuǎn)運(yùn)至膜內(nèi)的過(guò)程決定著類(lèi)固醇和膽汁酸的合成速度[21]。

當(dāng)前，放射性配基受體結(jié)合分析法仍然是神經(jīng)科學(xué)研究中的重要手段之一[22-23]。我們采用與PBRs具有高特異拮抗活性的[3H]PK11195配體進(jìn)行受體飽和實(shí)驗(yàn)并做Scatchard曲線分析。結(jié)果顯示，模型組大鼠腦皮層線粒體PBRs結(jié)合活性和代表受體數(shù)量的Bmax值較對(duì)照組均明顯升高，地蘇合劑中、高劑量組結(jié)合活性較模型組降低，高劑量組大鼠Bmax值較模型組明顯降低。Bmax值越大，受體數(shù)量或密度越大。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肝性腦病大鼠腦皮層PBRs可能存在著受體表達(dá)數(shù)量增加，表明[3H]PK11195結(jié)合量升高可作為神經(jīng)損傷的一種標(biāo)志，并可能成為用以解釋藥物作用的新靶點(diǎn)[24-25]。

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