婦血寧顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張伏軍，尹小玲，李卿，須建（.重慶三峽中心醫(yī)院藥劑科，重慶市404000；.重慶市中藥研究院，重慶市 400065；.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶市 40）

婦血寧顆粒是在多年使用的臨床驗(yàn)方基礎(chǔ)上，經(jīng)現(xiàn)代工藝制成的中藥復(fù)方制劑，本品由三七、斷血流、阿膠等藥材組成，臨床證實(shí)其具有養(yǎng)血止血、祛瘀補(bǔ)虛的功效，適用于治療瘀血出血、血虛出血以及婦科各類血證。為有效控制其質(zhì)量，筆者對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，用薄層色譜（TLC）法對(duì)制劑中的三七、斷血流進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定三七中的有效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的含量。

1 儀器與試藥

1100HPLC儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)惠普公司）；薄層成像色譜儀（瑞士卡瑪公司）。

三七皂苷R1（批號(hào)：110745-700415）、人參皂苷Rb1（批號(hào)：0703-200118）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-700425）對(duì)照品和三七（批號(hào)：120941-200506）、斷血流（批號(hào)：120579-200704）對(duì)照藥材，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；婦血寧顆粒（重慶市中藥研究院自制，批號(hào)：101001、101101、101102）；缺三七陰性樣品、缺斷血流陰性樣品由重慶市中藥研究院中藥化學(xué)研究所提供；甲醇為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 三七的TLC鑒別 取本品2 g，研細(xì)，加甲醇20m L，水浴回流30m in，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0m L使溶解，用水飽和正丁醇提取2次，每次20m L，合并水飽和正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?m L使溶解，作為供試品溶液；另取三七對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1m L各含1 mg的溶液，作為混合對(duì)照品溶液；另取缺三七陰性樣品2 g，同法制成缺三七陰性對(duì)照溶液。照TLC法[1]試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。三七的TLC見圖1。

2.1.2 斷血流的TLC鑒別 取本品2 g，研細(xì)，加甲醇20m L，水浴回流30min，濾過，濾液過中性氧化鋁柱，用40%甲醇40 m L洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0m L使溶解，用水飽和正丁醇提取2次，每次20m L，合并水飽和正丁醇提取液，用水洗滌2次，每次20m L，棄去水液，水飽和正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?m L使溶解，作為供試品溶液；另取斷血流對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取缺斷血流陰性樣品2 g，同法制成缺斷血流陰性對(duì)照溶液。照TLC法[1]試驗(yàn)，吸取上述溶液各8μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。斷血流的TLC見圖2。

圖1 三七的TLC 1.缺三七陰性對(duì)照；2.三七對(duì)照藥材；3.供試品；4.混合對(duì)照品（從下往上依次為人參皂苷Rb1、三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1）Fig 1 TLC of Panax notoginseng 1.negative control w ithout P.notoginseng；2.Notoginseng Radix etRhizoma reference substance；3.test sample；4.m ixed contro（lthey were as follws from the bottom up：ginsenoside Rb1，notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1）

圖2 斷血流的TLC 1.供試品；2.斷血流對(duì)照藥材；3.缺斷血流陰性對(duì)照Fig 2 TLC of Clinopodium Herb 1.testsample；2.Clinopodium Herb referencesubstance；3.negative controlw ithoutClinopodium Herb

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Symmetry C18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流 動(dòng) 相 ：甲 醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0→30min，15%A→45%A；30→40 m in，45%A→65%A；40→50 min，65%A→80%A）；流速：1.0 m L·m in-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按三七皂苷R1色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000，陰性對(duì)照溶液在混合對(duì)照品相應(yīng)位置無色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無干擾。色譜見圖3。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品約2.5 g，精密稱定，加水30m L使溶解，水飽和正丁醇提取4次，每次20 m L，合并水飽和正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次50m L，棄去氨試液，水飽和正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状歼m量使溶解，移置5m L量瓶中，加甲醇定容，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 m L含三七皂苷R10.22mg、人參皂苷Rb10.41mg、人參皂苷Rg10.37mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺三七陰性樣品，照上述供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、16、20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為Y三七皂苷R1＝912 846X三七皂苷R1－1 971.5（r＝0.999 8）、Y人參皂苷Rb1＝1 320 459X人參皂苷Rb1－2 711（r＝0.999 9）、Y人參皂苷Rg1＝1 215 946X人參皂苷Rg1－3 047（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1進(jìn)樣量分別在0.44～4.40、0.82～8.20、0.74～7.40μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為0.84%、0.97、0.92%（n均為6），表明儀器精密度良好。

圖3 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.缺三七陰性對(duì)照；1.三七皂苷 R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1Fig 3 HPLC chromatogram s A.m ixed control；B.test sample；C.negative control w ithout P.notoginseng；1.notoginsenoside R1；2.ginsenoside Rg1；3.ginsenoside Rb1

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取樣品1份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下條件分別于0、1、4、8、10、14 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為1.01%、0.95、1.04%（n均為6）。表明供試品溶液在14 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定峰面積。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的RSD分別為1.12%、1.08%、0.99%（n均為6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的同批樣品6份，分別精密加入三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Resultsof revovery test

2.3 樣品含量測(cè)定

精密稱取3批樣品（批號(hào)：101001、101101、101102）各2.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。

3 討論

試驗(yàn)中，鑒別三七和斷血流[2]所采用的TLC法不受樣品中其他各藥的干擾，專屬性較強(qiáng)，簡(jiǎn)單易行，可作為本品中三七、斷血流定性檢測(cè)方法；筆者曾對(duì)制劑中阿膠進(jìn)行了TLC鑒別方法的研究，由于處方中阿膠量較小，TLC鑒別方法缺乏專屬性，故未能納入標(biāo)準(zhǔn)。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Resultsof contentsdeterm ination

本制劑由三七、斷血流等藥材提取制成，樣品成分復(fù)雜，采用HPLC法測(cè)定三七中主要成分含量，對(duì)供試品溶液的提取方法進(jìn)行了比較[3～9]：中性氧化鋁吸附法、水飽和正丁醇萃取法、大孔樹脂法。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用樣品加水使溶解，水飽和正丁醇萃取，氨試液洗滌的方法操作較簡(jiǎn)便，且含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，故納入標(biāo)準(zhǔn)。

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