銀杏內(nèi)酯B對(duì)胚胎大鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞的作用研究

譚才宏，錢小薔，馬洪峰（.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，鎮(zhèn)江市00；.江蘇丹陽市人民醫(yī)院藥劑科，丹陽市 300）

銀杏提取物含有多種活性成分，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J和白果內(nèi)酯。銀杏內(nèi)酯B（GBE）具有抗炎、抗過敏、抗休克、抗腫瘤等廣泛的生物學(xué)作用。其不但對(duì)缺血、缺氧等多種因素引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，而且還具有促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，防治老年性癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等諸多重要作用。從細(xì)胞學(xué)方面來說，近年來，GBE對(duì)細(xì)胞的作用研究很多，如GBE能拮抗谷氨酸所致的腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞毒性作用；GBE對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用；GBE對(duì)膽固醇和載脂蛋白E4（ApoE4）共損傷海馬神經(jīng)元膽堿能系統(tǒng)具有保護(hù)作用；GBE可促進(jìn)分化細(xì)胞成熟，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化；GBE可拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡等[1，2]。而GBE對(duì)中腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制的探討未見文獻(xiàn)報(bào)道。

海人藻酸（KA）能使胞漿或線粒體內(nèi)超氧化物岐化酶（SOD）水平降低或消失，其通過降低神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧自由基的清除能力而使得氧自由基在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)聚集，引起細(xì)胞的繼發(fā)性損傷[3～5]。因此，自由基導(dǎo)致細(xì)胞膜和線粒體損傷作用成為KA引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要因素。本文以此為模板探討GBE對(duì)中腦神經(jīng)細(xì)胞作用的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電子天平（上海天平儀器廠）；微量加樣器（法國(guó)Gildon公司）；M 200型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；Mz12.5型體視顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Shellab公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；TDL-5C型臺(tái)式低速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

GBE（批號(hào)：071204）、左旋多聚賴氨酸（批號(hào)：070716）、MTT（批號(hào)：070416）、KA（批號(hào)：080264）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM干粉培養(yǎng)基（批號(hào)：070405），胰蛋白酶（1∶250）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司，批號(hào)：080103）；臺(tái)盼藍(lán)（上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司）；神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF，北京邦定公司，批號(hào)：070106）；一氧化氮（NO）、SOD、丙二醛（MDA）試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 動(dòng)物

健康成年Wistar大鼠，♀♂（2∶1），體重（250±20）g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（蘇）2008-0024）。下午6：00合籠，次晨鏡檢♀鼠陰道的精子，以檢出精子為0 d，第14天孕鼠脫頸椎法處死。

2 方法

2.1 胚胎大鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞懸液的制備

取14 dWistar孕鼠，用頸椎脫落法處死，放入盛有75%酒精容器內(nèi)，消毒5m in，于無菌條件下取出胚胎浸于培養(yǎng)基中，無菌取胎鼠中腦組織；用PBS液洗凈血污，剪碎，置0.25%胰蛋白酶溶液中37℃消化5m in，吸除消化液，用含血清的培養(yǎng)基終止消化；加完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液。200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾。

2.2 胚胎大鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至4×106個(gè)/m L的細(xì)胞懸液，細(xì)胞接種在涂有10mg·L-1左旋多聚賴氨酸多孔培養(yǎng)板上，于CO2培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)。24 h待大部分細(xì)胞貼壁后，全量換液1次，以后每2～3 d半量換液。此法不需使用抑制膠質(zhì)細(xì)胞的藥物，減少了藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，使神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)更接近自然環(huán)境。

2.3 分組

試驗(yàn)分為7組，即正常對(duì)照、GBE對(duì)照（50mg·L-1）、KA（100 μmol·L-1）、NGF（50mg·L-1）和GBE高、中、低劑量（100、50、25mg·L-1）組。每個(gè)劑量為6孔，每孔400 μL。于中腦神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)第10天，分別測(cè)定指標(biāo)。

2.4 神經(jīng)元鑒定

采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）免疫組化法染色對(duì)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。

2.5 中腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)MDA、NO含量和SOD活性測(cè)定

用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，再用PBS漂洗3次，制成單細(xì)胞懸液，低溫超聲粉碎細(xì)胞，4 000 r·min-1離心，取出上清液待測(cè)。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD的活性；改良的硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量；硝酸還原酶法測(cè)定NO含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 NSE免疫組化染色對(duì)神經(jīng)元的鑒定

NSE免疫反應(yīng)呈棕黃色，顆粒狀，陽性染色分布于神經(jīng)元的胞質(zhì)及突起中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不著色。GBE高、中、低劑量組細(xì)胞生長(zhǎng)、分化程度明顯好于KA組。免疫組化圖片見圖1。

圖1 免疫組化圖片A.正常對(duì)照組；B.GBE對(duì)照組；C.KA組；D.GBE低劑量組；E.GBE中劑量組；F.GBE高劑量組；G.NGF組Fig 1 Immunohistochem icalpictures A.normal control group；B.GBE control group；C.KA group；D.GBE low dose group；E.GBEmedium dose group；F.GBE high dose group ；G.NGFgroup

3.2 中腦神經(jīng)細(xì)胞SOD活性和NO、MDA含量的測(cè)定

KA組SOD活性顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；GBE高、中、低劑量組SOD活性隨著GBE濃度的增大而增強(qiáng)，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01或P＜0.05）。

KA組MDA、NO含量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；GBE高、中、低劑量組MDA和NO含量隨著GBF濃度的增大而逐漸減小，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01或P＜0.05）。中腦神經(jīng)細(xì)胞SOD活性、MDA和NO含量測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 中腦神經(jīng)細(xì)胞SOD活性、MDA和NO含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Results of the SOD activities，MDA and NO contents ofm idbrain neuron（s±s，n＝6）

表1 中腦神經(jīng)細(xì)胞SOD活性、MDA和NO含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Results of the SOD activities，MDA and NO contents ofm idbrain neuron（s±s，n＝6）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與KA組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.KA group：#P＜0.05，##P＜0.01

NO/μmol·L-1 33.253±3.158 32.477±2.308 82.808±5.032＊＊78.453±2.089#62.873±3.284##51.390±2.400##60.266±3.737##組別正常對(duì)照組GBE對(duì)照組KA組GBE低劑量組GBE中劑量組GBE高劑量組NGF組SOD/U·mg-1 133.39±7.507 140.085±3.692＊79.600±2.128＊＊83.858±4.661#96.125±5.734##111.528±4.548##98.073±5.729##MDA/nmol·mg-1 2.747±0.088 2.613±0.107＊6.892±0.123＊＊6.618±0.222#6.358±0.189##5.965±0.112##5.933±0.143##

4 討論

中腦神經(jīng)細(xì)胞損傷是多種病理機(jī)制相互作用的結(jié)果。在諸多損傷機(jī)制中，主要是線粒體內(nèi)電子傳遞失調(diào)致使氧分子接受單個(gè)電子生成氧自由基，同時(shí)黃嘌呤氧化酶（XO）系統(tǒng)被激活，XO在將ATP的降解產(chǎn)物次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤的同時(shí)，產(chǎn)生大量氧自由基。另外，SOD等自由基清除系統(tǒng)被大量消耗，造成自由基堆積。自由基損傷的主要病理機(jī)制是引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。由于腦組織中富含脂質(zhì)，極易受到自由基的攻擊，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，激起自由基連鎖和增殖反應(yīng)，形成一系列脂質(zhì)自由基及其降解產(chǎn)物MDA。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，自由基產(chǎn)生與腦缺氧、缺血性損傷有關(guān)，并認(rèn)為氧化應(yīng)激在其發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[6]。正常生物氧化過程中，活性氧自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)外界因素打破這種平衡時(shí)，過量產(chǎn)生的自由基可誘發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。與其他臟器相比，胚胎中腦組織更易受自由基的攻擊。腦內(nèi)的SOD等抗氧化物水平改變，腦組織抗氧化能力就會(huì)失去平衡，因此胚胎中腦脂質(zhì)過氧化的發(fā)生率最高[7]。脂質(zhì)過氧化發(fā)展到一定程度使細(xì)胞膜失去流動(dòng)性，膜電位降低，膜對(duì)離子通透性增加，線粒體不能產(chǎn)生能量，溶酶體水解酶外漏，與蛋白質(zhì)反應(yīng)滅活酶，抑制蛋白質(zhì)的合成，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂和組織溶解。

本研究用不同濃度GBE作用于中腦神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果表明，當(dāng)GBE濃度在25～100mg·L-1范圍內(nèi)具有明顯的抗自由基作用，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞抵抗KA損傷的能力。其作用強(qiáng)度與NGF相當(dāng)，這可能與GBE的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。

從NO和MDA數(shù)據(jù)分析，GBE組與正常對(duì)照組相比相差不大。以前的研究表明，GBE能對(duì)興奮性神經(jīng)毒過程中的細(xì)胞提供保護(hù)作用[8]。在研究中筆者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，GBE只有在與KA同時(shí)使用處理細(xì)胞才能有效地抑制KA所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷，單獨(dú)使用GBE對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的NO和MDA無明顯影響。這間接的表明血小板活化因子（PAF）可能作為第二信使參與了KA誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的信號(hào)傳遞過程，這與Mukherjee PK等[9]研究結(jié)果一致。GBE可能通過競(jìng)爭(zhēng)PAF受體阻斷PAF介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒信號(hào)傳遞過程，提高抗氧化酶的活性和清除自由基，從而提供神經(jīng)保護(hù)作用。GBE高、中、低劑量組NO和MDA含量遠(yuǎn)低于KA組（P＜0.01或P＜0.05），并呈現(xiàn)濃度依賴性，進(jìn)一步說明GBE具有抗自由基作用，能更好地保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的DNA蛋白質(zhì)，使膜脂質(zhì)不被氧化損傷。

綜上所述，GBE對(duì)中腦神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用和保護(hù)作用機(jī)制可能與GBE提高細(xì)胞的SOD活性，降低細(xì)胞的NO、MDA含量有關(guān)。

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