抗腹瀉性貝毒軟海綿酸多克隆抗體的制備與檢測(cè)

胡樂(lè)琴，汪 卿，柳俊秀，何培民

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 浦東 201306）

腹瀉性貝毒素是多醚類赤潮藻毒素，其成分主要有軟海綿酸（okadaic acid，OA）、鰭藻毒素（dinophysis toxins，DTX）。OA是蛋白磷酸酶PP1（Protein Phosphatase）和 PP2A（ser／thre Protein Phosphatase 2A）的特異性抑制劑，通過(guò)特異性地作用于蛋白磷酸酶PP1和PP2A抑制酶的去磷酸化，引起信號(hào)傳導(dǎo)途徑的變化，造成機(jī)體中毒［1］。OA還是腫瘤促進(jìn)因子，可引致DNA加合物形成［2］。對(duì)水體和貝類產(chǎn)品進(jìn)行毒素快速檢測(cè)是預(yù)防藻毒危害的有效方法。

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)利用抗原與抗體專一、特異性結(jié)合的特點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，是一種高度靈敏高度特異的檢測(cè)方法。1964年Johnson等首次成功制備了抗STX的多克隆抗體，后Adachi M等人［3］進(jìn)入了藻毒素的單抗研究。目前市場(chǎng)上已經(jīng)有幾種藻毒素的免疫檢測(cè)試劑盒和試紙條，用于藻毒素的快速檢測(cè)。

關(guān)于大田軟海綿酸單克隆抗體的制備在國(guó)內(nèi)已有報(bào)道［4］，但尚未見(jiàn)到多克隆抗體的研究。有關(guān)大田軟海綿酸多克隆抗體的制備與檢測(cè)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)動(dòng)物：雄性新西蘭白兔，體重為2～2.5kg，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所抗體中心。大田軟海綿酸（OA）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京伊普瑞斯科技有限公司。用甲醇稀釋成100ng／μL貯存于-20℃冰箱備用；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA），N-羥丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide）、N，N雙環(huán)乙烷碳二亞胺（N，N-dicyclohexylcarbodiimide，DCC）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethy-formamide，DMF）、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、鄰苯二胺（OPD）等為Sigma公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔Ig-HRP和底物TMB-H2O2購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，GelDoc凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad，NC膜購(gòu)自Sigma公司，TTBS購(gòu)自Invitrogen-Dynal。

1.2 完全抗原的制備 OA與BSA偶聯(lián)的方法是按參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行，僅將文獻(xiàn)中的載體蛋白牛甲狀腺球蛋白（BTG）改用牛血清白蛋白（BSA）。具體方法如下：取4.5mg N一羥丁二酰亞胺、9mg N，N-雙環(huán)乙烷碳二亞胺溶于30mL MES緩沖液（0.05 mol／L，0.5mol／L NaCl，pH 值5.0），充分溶解，取50μL加入到100μL含1mg OA的DMSO溶液中，25℃反應(yīng)15min；另稱取3mg BSA，用500μL磷酸鹽緩沖液（PBS）（0.01mol／L pH 值7.4）溶解；將上述活化的OA和10μL吡啶加入BSA溶液中，在室溫條件下輕速攪拌6h，再放置4℃冰箱過(guò)夜。第2天取出，分別用0.01mol／L pH值9.5的碳酸鹽緩沖液和0.01mol／L pH值7.4PBS透析，分裝、-20℃保存，用作免疫抗原。

1.3 偶聯(lián)效果的檢測(cè) 用乙醇精確配制OA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.01mol／L pH值7.4PBS配制BSA的標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取一定量的OA-BSA溶于PBS中，用Braford法測(cè)其蛋白質(zhì)的濃度。根據(jù)此濃度調(diào)整OABSA溶液中蛋白質(zhì)的濃度，使其與PBS一致。取2 mL OA溶液（10μg／mL）、取2mL BSA溶液（1mg／mL）和2mL OA-BSA溶液，以PBS為空白對(duì)照，用紫外分光掃描儀在波長(zhǎng)200～500nm的范圍內(nèi)逐一掃描它們吸收光譜，在最大吸收峰處的波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，參照文獻(xiàn)［6］估算OA與BSA的偶聯(lián)比。

1.4 動(dòng)物的免疫 取雄性新西蘭白兔（體重為2～2.5kg）2只（07160＃和07161＃），按以下程序免疫。免疫流程：用OA-BSA與福氏佐劑混合，乳化后，皮下和皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫。OA-BSA的劑量為0.6mg／次·兔。首次免疫用福氏完全佐劑，再次免疫用不完全福氏佐劑。免疫的間隔時(shí)間為3周。第3次免疫后1周，給兔放血，待血液凝固后放37℃溫箱1h，然后4℃冰箱過(guò)夜。第2天用4℃低溫離心機(jī)3000r／min收集上清液即為多克隆抗體。

1.5 抗體純化 采用飽和硫酸銨法純化抗體［6］，再用親合層析柱進(jìn)一步純化。-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 抗血清效價(jià)的測(cè)定-間接ELISA 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定方法：包被抗原設(shè)置二組，一組包被抗原為OA-BSA；一組包被抗原為BSA。每個(gè)包被抗原做3個(gè)待測(cè)樣品：免疫前血清；免疫后抗血清；免疫后抗血清加BSA中和。檢測(cè)方法：用包被緩沖液將包被抗原稀釋成2μg／mL的濃度，在酶標(biāo)板每孔中加入100μL，做3個(gè)重復(fù)。密封后4℃ 過(guò)夜，棄去包被抗原，洗滌液洗滌3次，加入200μL封閉液37℃ 溫育1h。每孔加入100μL待測(cè)抗血清，37℃溫育2h，棄去抗血清，洗滌液洗滌3次；每孔加入100μL酶標(biāo)二抗工作液（羊抗兔Ig-HRP），37℃溫育1h，棄去酶標(biāo)二抗工作液 ，洗滌液洗滌3次；每孔加入100μL底物溶液（TMB-H2O2），37℃避光顯色15min后，每孔加入50μL 2mol／L H2SO4終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取450nm的吸光度值。

每組設(shè)置空白對(duì)照（本底），方法是以稀釋液代替待測(cè)血清進(jìn)行反應(yīng)。

1.7 抑制率檢測(cè) 先用甲醇溶解OA標(biāo)準(zhǔn)品，再用去離子水稀釋成不同濃度OA稀釋液，濃度分別為6.25、5、2.5、1.25、0.625、0μg／L，分別取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μL和血清稀釋液50μL封閉孔內(nèi)，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)2h。其余步驟與間接ELISA法相同，測(cè)定OD值，計(jì)算達(dá)到50%抑制率時(shí)的OA質(zhì)量濃度值（IC50值），確定單抗對(duì)OA的親和性。抑制率的計(jì)算公式如下：抑制率=（1-OD450sam／OD450max）×100%

其中，OD450sam表示競(jìng)爭(zhēng)性孔的OD值，OD450max表示未加藥物抑制的孔的OD值。

1.8 Dot Blot檢測(cè)OA-BSA兔抗血清特異性反應(yīng)Dot-blot檢測(cè)方法如下：將BSA、OA-BSA、OVA直接點(diǎn)于NC膜上，點(diǎn)樣量均為0.2μg。用含5%脫脂奶粉的TTBS（w／v）溶液4℃封閉2h，滴加一抗（1∶～，用5%BSA in TTBS（w／v）稀釋）4℃過(guò)夜。TTBS洗脫1min，重復(fù)洗脫4次。滴加二抗羊抗兔IgG（H+L）-HRP（1∶～），37℃孵育2 h，TTBS洗膜10min 4次，TBS洗膜10min，按ECL試劑盒說(shuō)明進(jìn)行顯色，GelDoc凝膠成像儀采集圖象。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫抗原偶聯(lián)效果 圖1為OA-BSA免疫抗原偶聯(lián)效果的紫外掃描鑒定結(jié)果。從圖1可見(jiàn)，OA與BSA經(jīng)DCC反應(yīng)后，其產(chǎn)物OA-BSA的紫外吸收?qǐng)D譜與載體BSA相比，吸收峰和吸收曲線均發(fā)生了改變。其中，OA-BSA吸收峰在262nm處，與OA的吸收蜂相同，而BSA吸收峰在280nm處；OA-BSA的蛋白濃度與BSA相同，但OA-BSA最大吸收峰值大約是BSA兩倍?？梢?jiàn)OA與BSA已發(fā)生結(jié)合，且OA與BSA的結(jié)合率大約為18。

2.2 抗血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果 ELISA檢測(cè)多抗血清效價(jià)結(jié)果如表1。表1所示結(jié)果表明，來(lái)自07160＃和07161＃兔的抗血清中含有針對(duì)OA的抗體。因?yàn)橛肂SA中和后的抗血清，對(duì)BSA呈陰性反應(yīng)，而對(duì)OA-BSA仍呈較強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。

2.3 抑制率測(cè)定結(jié)果 以吸光率B／B0（B是OA不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的OD值，B0是OA（標(biāo)準(zhǔn)濃度的OD值）為縱坐標(biāo)，以O(shè)A不同濃度×10的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線見(jiàn)圖2，進(jìn)行回歸分析。經(jīng)計(jì)算McAb對(duì)OA的IC50為2.852ng／mL。

圖1 偶聯(lián)物及產(chǎn)物紫外掃描圖

圖2 OA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA工作曲線

2.4 Dot Blot結(jié)果 OA-BSA兔抗血清特異性反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果如圖3、圖4。從圖中可知，抗血清與BSA、OVA均無(wú)反應(yīng)，而與OA-BSA有反應(yīng)，說(shuō)明抗血清為OA特異抗體。

表1 第3次免疫后兔抗OA抗體ELISA方法檢測(cè)

3 討論

酶免疫測(cè)定技術(shù)具有高度特異性和優(yōu)良的穩(wěn)定性，并且可以被開(kāi)發(fā)成簡(jiǎn)便實(shí)用的試劑盒和試劑條，成為藥物檢測(cè)和毒素檢測(cè)中具有研究和開(kāi)發(fā)前景的熱點(diǎn)，而獲得高質(zhì)量的抗體是實(shí)現(xiàn)免疫分析檢測(cè)的核心和基礎(chǔ)。

通常相對(duì)分子質(zhì)量小于1，000的物質(zhì)是不具有免疫原性的，需要與載體蛋白偶聯(lián)形成結(jié)合物后才具有免疫原性。OA為多聚醚類小分子化合物，相對(duì)分子量為804.5，不具有直接產(chǎn)生抗體的特性，而需要偶聯(lián)到大分子的載體上。目前，常用來(lái)作為小分子人工抗原的載體蛋白有牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）、人IgG及人工合成的多聚賴氨酸（PLL）等。于光、盧士英［6］等（2006）將OA與人IgG偶聯(lián)制備免疫原 OA-人IgG，其免疫效果很好。Shiro Matsuura［7］（1994）也采用人IgG作為載體制備免疫原OA-人IgG，用其研制的抗體建立的ELISA，最低的檢測(cè)限為30ng／mL。Nuria M Llamas［8］（2007）用 OA 與牛甲狀腺球蛋白偶聯(lián)制備免疫原制備多抗，建立免疫生物傳感器檢測(cè)OA技術(shù)，OA50%抑制的質(zhì)量濃度為148 ng／g。本文采用OA與BSA偶聯(lián)制備免疫原，用其研制的多抗，經(jīng)間接ELISA鑒定，OA50%抑制的質(zhì)量濃度為2.852ng／mL，抗體質(zhì)量較好，特異性反應(yīng)強(qiáng)，可作為制備檢測(cè)試劑的材料。

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