氯沙坦對進展性腎炎模型大鼠腎小管-間質(zhì)細胞巨噬細胞移動抑制因子的影響研究Δ

查艷，趙盈葶，楊霞，陳運芬，俞雷（.貴州省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴陽市550004；2.貴州省電力醫(yī)院，貴陽市 550004）

氯沙坦（Losartan）是血管緊張素Ⅱ受體1型拮抗藥，具有降壓和減少尿蛋白的療效[1]；但其抑制腎小管-間質(zhì)炎癥反應，從而保護腎功能的具體機制目前尚不完全清楚。巨噬細胞（巨噬細胞標記抗原ED-1+的細胞）作為腎組織的主要炎癥浸潤細胞存在于許多原發(fā)和繼發(fā)性腎臟疾病中，巨噬細胞移動抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）與腎臟組織學損害、蛋白尿程度及腎功能衰退密切相關[2，3]。因此，筆者在進展性腎炎（Progressive nephritis）大鼠模型[4]中，觀察腎小管-間質(zhì)細胞MIF的表達與間質(zhì)炎癥的相關性，以及給予不同劑量氯沙坦干預后MIF在腎小管-間質(zhì)細胞中表達的變化，探討氯沙坦是否可以通過調(diào)節(jié)MIF的表達來改善腎小管-間質(zhì)的炎癥反應。

1 儀器與材料

1.1 儀器

全自動多功能生化分析儀（日本Hitachi公司）；SN-628放射免疫γ計數(shù)儀（中國科學院上海原子核研究所）；光學顯微鏡、C3040-ADU顯微圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）；LE5001鼠尾無創(chuàng)血壓測量儀（美國普升科技有限公司）。

1.2 試藥

氯沙坦片（杭州默沙東制藥公司，批號：100576，規(guī)格：每片50 mg）；小鼠抗大鼠MIF抗體、小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體、鼠單克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗體（IgG（OX-7）mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody）、正常山羊血清（美國Santa Cruz Biotechnology公司）；LSAB免疫組織化學（組化）試劑盒（丹麥Dako公司）。

1.3 動物

Wistar大鼠，♂，體重（126.7±10）g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，二級，合格證號：SCXK（渝）2007-0005。

2 方法

2.1 建模與給藥[5]

取大鼠行右腎切除并注射鼠單克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗體2次建立進展性腎炎大鼠模型，于第4周時取部分大鼠立即處死作為模型組，將剩余模型大鼠分為對照組和氯沙坦高、低劑量組（80、20 mg·kg－1·d－1），再另取大鼠行假手術作為假手術組，每組5只，連續(xù)給藥4周。實驗第8周時在麻醉狀態(tài)下處死剩余所有大鼠，取左腎標本，于－70℃冰箱保存。

2.2 觀察指標

2.2.1 MIF、ED-1的免疫組化染色。取10%中性甲醛固定的3μm厚石蠟腎組織切片，常規(guī)脫蠟、水化；浸入3%H2O210 min除去內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次3～5 min；微波修復抗原，PBS洗3次，每次3～5 min；正常山羊血清封閉10 min，PBS洗3次，每次3～5 min；滴加稀釋的一抗鼠單克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗體（1∶100，V/V），4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3～5 min；分別滴加小鼠抗大鼠MIF抗體及小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體（1∶50），室溫孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素輕度復染，以PBS洗3次，每次3～5 min，脫水，透明，封片。檢測采用顯微圖像分析系統(tǒng)對各組染色結果進行積分光密度（IOD）測定，每張切片隨機選取10個高倍視野（400倍），每個視野代表0.13 mm2的區(qū)域面積，計算其IOD，取平均值作為MIF、ED-1的表達情況。

2.2.2 MIF和ED-1在同一個細胞內(nèi)的表達檢測。采用微波免疫組化雙重染色檢測，取對照組腎組織切片，第1重染色同“2.2.1”項下“常規(guī)脫蠟……4℃過夜，PBS洗3次，每次3～5 min”操作，再滴加小鼠抗大鼠MIF抗體（1∶100稀釋），DAB顯色，陽性物呈棕色。完成第1重染色后將切片浸人0.01 mmol·L－1、pH6.0的枸櫞酸緩沖液中置微波爐加熱（800 W）10 min，自然冷卻至室溫后用PBS洗滌，接著用巨核細胞酶標染色（APAAP）法行第2重染色，滴加小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體（1∶500稀釋），再孵育、顯色、沖洗后觀察陽性物呈紫藍色。

2.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.3統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析。相關分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 MIF、ED-1的免疫組化檢測結果

3.1.1 MIF的表達。結果表明，假手術組MIF幾乎無表達，與其比較，模型組和對照組MIF表達顯著升高（P＜0.001），主要集中在腎小管-間質(zhì)細胞的胞漿。與模型組和對照組比較，氯沙坦高、低劑量組MIF表達明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。具體指標詳見表1。切片圖見圖1。

表1 各組大鼠MIF、ED-1表達比較（±s，n＝5）Tab 1 Comparison of MIF and ED-1 in each group（±s，n＝5）

表1 各組大鼠MIF、ED-1表達比較（±s，n＝5）Tab 1 Comparison of MIF and ED-1 in each group（±s，n＝5）

與假手術組比較：＊P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.01，##P＜0.001；與對照組比較：ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.001vs.sham operation group：＊P＜0.001；vs.model group：#P＜0.01，##P＜0.001；vs.control group：ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.001

指標MIF/×103 ED-1/×103假手術組1.81±0.24 1.64±0.13模型組54.28±5.64＊27.96±4.15＊對照組58.79±6.02＊31.47±4.09＊氯沙坦低劑量組24.05±3.18#Δ 4.16±0.52##ΔΔ氯沙坦高劑量組22.64±3.46#Δ 2.32±0.19##ΔΔ

圖1 各組大鼠腎組織MIF和ED-1表達的切片圖（×200）Fig 1 Slice map of MIF and ED-1 expression of kinedy tissue in each grou（p×200）

3.1.2 ED-1的表達。結果表明，假手術組ED-1幾乎無表達，與其比較，模型組和對照組ED-1表達顯著升高（P＜0.001），主要集中在腎小管-間質(zhì)細胞的胞漿。與模型組和對照組比較，氯沙坦高、低劑量組ED-1表達明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。具體指標詳見表1。切片圖見圖1。

3.2 MIF和ED-1在同一個細胞內(nèi)的表達檢測結果

MIF（棕色）和ED-1（藍紫色）同時顯色在腎小管-間質(zhì)細胞的胞漿見圖2。

4 討論

MIF蛋白含114個氨基酸，由α鏈和β鏈組成三維晶體結構，其不僅主要由巨噬細胞產(chǎn)生，而且可作用于巨噬細胞，引起巨噬細胞在局部浸潤、增生以及刺激巨噬細胞分泌多種細胞因子[6]。MIF的主要生物效應是抑制巨噬細胞的游走，促進巨噬細胞在炎癥局部的聚集、增生、活化及分泌一些細胞因子如（白介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α），增強炎癥反應程度。有研究[7]發(fā)現(xiàn)在給大白兔注射腎毒血清的同時腹腔注射抗MIF中和抗體，能有效防止腎組織損害的發(fā)生、發(fā)展。但MIF在進展性腎炎中的作用及是否能夠通過阻斷MIF的表達而減輕腎小管間質(zhì)進行性損害尚未見文獻報道。

圖2 MIF和ED-1表達在腎小管-間質(zhì)同一個細胞的切片圖（×400）Fig 2 Slice map of MIF and ED-1 expression in same tubulointerstitial cell（×400）

本實驗采用免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)MIF、ED-1在假手術組的腎小管-間質(zhì)細胞中幾乎不表達，在模型組和對照組的腎小管-間質(zhì)細胞表達明顯升高（P＜0.001）。為了檢測MIF是否能抑制ED-1向其他組織擴散，本實驗采用雙重免疫組化染色檢測了MIF與ED-1是否在同一個細胞內(nèi)表達，結果表明MIF和ED-1同時顯色于同一個細胞的胞漿。這與既往的報道[6]相一致。經(jīng)過不同劑量氯沙坦治療4周后，進展性腎炎模型大鼠腎小管-間質(zhì)炎癥反應明顯改善，MIF和ED-1表達明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。有研究[8]提示，MIF可以刺激巨噬細胞增生、活化及分泌TNF-α等細胞因子；反過來，TNF-α也可以刺激MIF表達的上調(diào)，引起組織學損害。氯沙坦可能通過下調(diào)TNF-α的表達，從而抑制了MIF和ED-1在進展性腎炎模型大鼠腎小管-間質(zhì)細胞中的表達和聚集。其具體的作用機制有待于進一步的探討。

腎小管-間質(zhì)細胞的炎癥反應也是進展性腎炎的一個主要表現(xiàn)，是預測腎功能下降的重要標志。通過應用氯沙坦抑制腎小管-間質(zhì)細胞中MIF的表達，可能是早期控制炎癥反應，進而防治腎間質(zhì)纖維化的重要途徑之一。

[1] 朱俊峰，鄭金聰，劉茂伯.替米沙坦和氯沙坦治療高血壓的Meta分析[J].中國藥房，2008，19（29）：2 287.

[2]Nakima K，Tanaka Y，Nomiyama T，et al.RANTES promoter genotype is associated with diabetic nephropathy in type 2 diabetic subjects[J].Diabetes Care，2003，26（3）：892.

[3] 孔耀中，黃英偉.巨噬細胞移動抑制因子在原發(fā)性腎小球腎炎組織中的表達和意義[J].中華腎臟病雜志，2000，12（16）：383.

[4] Matsumoto M.Hypoperfusion of peritubular capillaries induces chronic hypoxia before progression of tubulointerstitial injury in a progressive model of rat glomerulonephritis[J].J Am Soc Nephrol，2004，15（6）：1 574.

[5] 查 艷，何平紅，龍艷君，等.氯沙坦對進展性腎炎模型大鼠腎小管-間質(zhì)細胞低氧誘導因子及結締組織生長因子的影響研究[J].中國藥房，2011，22（29）：2 711.

[6] Rice E，Tesch G，Mark S，et al.Induction of MIF synthesis and secretion by tubular epithelial cells：a novel action of angiotonsin Ⅱ[J].Kidney Int，2006，63（4）：1 265.

[7] Foote A，Brlganti EM，Kipen Y，et al.Macmphage migration inhibitory factor in systemic lupus erythematosus[J].J Rheumatol，2009，62（7）：268.

[8] Lan HY，Yang N，Hui W，et al.TNF-alpha up-regulates renal MIF expression in rat cresentic glomerulonephritis[J].Mal Med，2008，52（3）：136.