巨噬細(xì)胞金屬彈性蛋白酶抑制小鼠結(jié)腸癌中bFGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

徐張巍 許建明 石 海 梅 俏

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（230031）

結(jié)直腸癌是消化道常見惡性腫瘤之一，目前臨床上主要采取以手術(shù)為主的綜合性治療，由于缺乏有效的抗腫瘤血管生成靶點(diǎn)，迄今尚無令人滿意的生物學(xué)治療手段。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，巨噬細(xì)胞游走抑制因子（MIF）缺失的ApcMin/+小鼠，腸道腺瘤數(shù)量減少，體積減小[1]，表明巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可抑制腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。這類腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以特異性地表達(dá)巨噬細(xì)胞金屬彈性蛋白酶（macrophage metalloelastase,MME），MME為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）家族成員之一，又名MMP-12，可降解細(xì)胞外基質(zhì)組分如彈性蛋白，是巨噬細(xì)胞穿透基底膜、浸潤(rùn)腫瘤組織必不可少的活性產(chǎn)物。與其他MMPs與惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)不同，實(shí)驗(yàn)[2]顯示MME能通過水解纖溶酶原產(chǎn)生血管抑素（angiostatin）抑制腫瘤血管生成，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用。臨床研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中MME過表達(dá)的結(jié)直腸癌和胃癌患者，腫瘤血管生成減少，腫瘤侵襲受抑，預(yù)后較佳。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）又名FGF-2，是一種強(qiáng)力內(nèi)皮細(xì)胞促分裂原，參與了腫瘤血管的生成，研究[5]顯示誘導(dǎo)抗bFGF免疫應(yīng)答可抑制小鼠結(jié)腸癌生長(zhǎng)和腫瘤血管生成。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MME可通過產(chǎn)生血管抑素抑制bFGF介導(dǎo)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[6]，關(guān)于MME與bFGF在結(jié)腸癌細(xì)胞和實(shí)體瘤中的關(guān)系，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤模型，旨在探討MME對(duì)腫瘤組織中bFGF表達(dá)的影響，及其對(duì)結(jié)腸癌的生長(zhǎng)抑制作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

6 ～ 8周齡雌性BALB/c小鼠（安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），MME羊抗鼠多克隆抗體、bFGF羊抗鼠多克隆抗體（Novus Biologicals），α-tubulin 單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology,Inc.）?？?RNA 提取試劑盒（SV Total RNA Isolation System,Promega Corporation），第一鏈cDNA合成試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（ShineProbe? Real Time qPCR MasterMix Kits）、bFGF實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物和熒光探針（TaqMan探針）合成（上海閃晶分子生物科技有限公司）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（StepOneTMReal-Time PCR System,Applied BiosystemsTMby Life Technologies）。

二、方法

1.小鼠皮下移植瘤模型的建立：重組質(zhì)粒pEGFP-C1-MME的鑒定和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT-26以及小鼠皮下移植瘤模型的建立已在前期實(shí)驗(yàn)中完成[2]。實(shí)驗(yàn)設(shè)MME轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，每組30只小鼠。成瘤后連續(xù)測(cè)定皮下腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。腫瘤體積=L（mm）×W2（mm2）×0.52，L 和 W 分別為腫瘤長(zhǎng)徑和短徑。接種CT-26細(xì)胞4周后處死小鼠，取皮下腫瘤，予相應(yīng)處理后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4周內(nèi)死亡小鼠的腫瘤組織亦納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.免疫組化染色：腫瘤組織4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，行SP法免疫組化染色，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。MME和bFGF一抗稀釋比例分別為1∶100和1∶200，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知染色陽性的切片作為陽性對(duì)照。MME的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)呈明顯棕黃色判定為MME表達(dá)陽性；bFGF的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，每張切片于高倍鏡下常規(guī)取上、下、左、右、中五個(gè)視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，平均>5%的腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色，判定為bFGF表達(dá)陽性。

3.蛋白質(zhì)印跡法：取約200 mg-80℃凍存的腫瘤組織，制備組織勻漿，離心后留取上清。將含約40μg總蛋白的樣品與等體積2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合，行SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后依次與一抗、二抗反應(yīng)，MME和bFGF一抗稀釋比例為1∶1000，內(nèi)參照α-tubulin抗體稀釋比例為1∶500。ECL顯影，BandScan 5.0凝膠圖像分析軟件行灰度掃描，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

4.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR：提取腫瘤組織總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的操作按試劑盒說明書進(jìn)行。bFGF上游引物 5’-GGA GTT GTG TCT ATC AAG GGA GTG T-3’，下游引物 5’-AGC AGC CGT CCA TCT TCC T-3’，TaqMan 探 針 5’-FAMTGC CAA CCG GTA CCT TGC TAT G-TAMRA-3’。內(nèi)參照GAPDH上游引物 5’-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3’，下游引物 5’-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA-3’，TaqMan 探針 5’-FAM-CCG CCT GGA GAA ACC TGC CAA GTA TG-TAMRA-3’。RT反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，40 ℃ 60 min，70 ℃10 min。PCR反應(yīng)條件：94℃ 4 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。利用已知基因拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)目的基因和內(nèi)參照基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得 ΔCt值，2-ΔΔCt法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間差異的分析采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±sx表示，組間差異的分析采用Student t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MME對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響

皮下接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MME的CT-26細(xì)胞2 ～ 3周后，MME對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用逐漸顯著，4周后MME轉(zhuǎn)染組皮下腫瘤平均體積為（536.56±85.73） mm3，顯著小于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的（1411.50±97.58）mm3和未轉(zhuǎn)染組的（1309.26±104.31） mm3（P<0.001），兩對(duì)照組間則無明顯差異。

MME轉(zhuǎn)染組小鼠4周內(nèi)死亡率為3.3%（1/30），顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的26.7%（8/30）和未轉(zhuǎn)染組的20.0%（6/30）（P<0.05），兩對(duì)照組間則無明顯差異。

二、腫瘤組織MME表達(dá)

免疫組化染色示MME轉(zhuǎn)染組大片腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中可見棕黃色染色，而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組僅腫瘤基質(zhì)中可見棕黃色染色，腫瘤細(xì)胞中未見染色（見圖1），提示MME轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中MME呈胞質(zhì)分泌性表達(dá)。

圖1 各組腫瘤組織中MME表達(dá)免疫組化染色圖（×200）

蛋白質(zhì)印跡分析示MME轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中可見約 57 kDa（1 Da=0.9921 u）的蛋白條帶，空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組則未見相應(yīng)條帶（見圖2）。結(jié)合免疫組化染色結(jié)果，提示MME轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中存在MME蛋白水平的表達(dá)。

圖2 各組腫瘤組織中MME表達(dá)蛋白質(zhì)印跡分析電泳圖

三、腫瘤組織bFGF表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR示，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中的bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為MME轉(zhuǎn)染組的2.7倍和2.5倍，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.56±0.06 和 0.53±0.07 對(duì) 0.21±0.04,P<0.01），兩對(duì)照組間則無明顯差異，提示重組MME具有抑制bFGF mRNA表達(dá)的作用。

免疫組化染色示MME轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中bFGF蛋白表達(dá)陽性率為23.3%（7/30），顯著低于空載體轉(zhuǎn)染組的76.7%（23/30）和未轉(zhuǎn)染組的83.3%（25/30）（P<0.01），表達(dá)強(qiáng)度亦明顯低于兩對(duì)照組（見圖3），兩對(duì)照組間則無明顯差異。

圖3 各組腫瘤組織中bFGF表達(dá)免疫組化染色圖（×100）

蛋白質(zhì)印跡分析示三組腫瘤組織中均可見約19 kDa的蛋白條帶，MME轉(zhuǎn)染組條帶模糊，而兩對(duì)照組條帶相對(duì)清晰（見圖4）?；叶葤呙璺治鍪綧ME轉(zhuǎn)染組bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組（1.86±0.47對(duì)5.14±0.71和4.73±0.59,P<0.01），兩對(duì)照組間則無明顯差異。結(jié)合免疫組化染色結(jié)果，提示重組MME具有抑制bFGF蛋白表達(dá)的作用。

圖4 各組腫瘤組織中bFGF表達(dá)蛋白質(zhì)印跡分析電泳圖

討 論

MME為MMPs家族成員之一，與其他MMPs促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用不同，MME對(duì)腫瘤進(jìn)展具有防御作用。Houghton等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，無論是在自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型還是實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型中，MME缺陷小鼠的Lewis肺癌模型肺轉(zhuǎn)移灶均顯著多于野生型小鼠；MME可在體內(nèi)減低腫瘤相關(guān)微血管密度，形成抗血管生成因素大于促血管生成因素的腫瘤微環(huán)境，從而延緩腫瘤生長(zhǎng)，該作用不依賴于血管抑素的產(chǎn)生。Asano等[8]檢測(cè)了112例結(jié)直腸癌組織中的MMPs家族成員表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移者原發(fā)灶中的MME mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于已發(fā)生肝轉(zhuǎn)移者，提示MME在抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移方面有一定積極意義。Zhang等[9]對(duì)胃癌患者的研究亦發(fā)現(xiàn)，MME mRNA表達(dá)陽性者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著低于表達(dá)陰性者，2年生存率顯著高于表達(dá)陰性者。

bFGF作為一種促分裂原和血管生成因子，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并通過化學(xué)激活作用誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移[10]，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。此外，bFGF對(duì)腫瘤細(xì)胞亦具有促增殖作用，能促進(jìn)惡性腫瘤形成[11,12]。包括結(jié)腸癌細(xì)胞在內(nèi)的多種實(shí)體瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)bFGF及其受體，表明bFGF可能通過自分泌作用刺激腫瘤細(xì)胞增殖[13]。一些研究提示bFGF可能為結(jié)直腸癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因子。Dirix等[14]檢測(cè)了包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的90例未經(jīng)治療和42例已接受治療的轉(zhuǎn)移癌患者的血清bFGF和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平，發(fā)現(xiàn)57%的未經(jīng)治療者血清bFGF和（或）VEGF水平升高；而在已接受治療者中，疾病進(jìn)展者58%bFGF和（或）VEGF水平升高，對(duì)治療有應(yīng)答者僅15%兩者水平升高。張陽德等[15]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性結(jié)直腸癌組織中的bFGF和VEGF mRNA表達(dá)水平與腫瘤血管侵犯、淋巴結(jié)受累、肝轉(zhuǎn)移和臨床病理分期相關(guān)。

血管抑素是重要的內(nèi)源性血管生成抑制因子，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，對(duì)腫瘤血管生成具有強(qiáng)烈抑制作用。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)MME能在體內(nèi)促進(jìn)血管抑素生成[2]，至于其是否能同時(shí)抑制腫瘤組織中bFGF的表達(dá)，從而調(diào)控結(jié)直腸癌的腫瘤血管生成，目前尚無相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤模型研究了MME對(duì)腫瘤組織中bFGF表達(dá)的影響，結(jié)果顯示接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1-MME的CT-26細(xì)胞的小鼠，皮下腫瘤組織中可檢測(cè)到MME蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、免疫組化染色和蛋白質(zhì)印跡分析顯示MME轉(zhuǎn)染組小鼠腫瘤組織中的bFGF mRNA和蛋白表達(dá)量以及蛋白表達(dá)陽性率均顯著低于空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，提示MME對(duì)bFGF的表達(dá)具有抑制作用，從而使腫瘤組織中新生毛細(xì)血管形成的連續(xù)過程受阻，因此以MME靶向拮抗bFGF可能有較好的臨床應(yīng)用前景。本研究結(jié)果示MME轉(zhuǎn)染組小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤的生長(zhǎng)顯著受抑。

綜上所述，MME對(duì)結(jié)腸癌腫瘤血管生成的抑制作用并不是單一層面的，除促進(jìn)血管抑素生成，特異性地作用于增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，使之萎縮、退變外，還可抑制bFGF的表達(dá)，對(duì)抗其促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移并促進(jìn)其凋亡，從而建立抗血管生成因素大于促血管生成因素的腫瘤微環(huán)境，以調(diào)控腫瘤血管生成，抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。

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