林可霉素利多卡因凝膠微生物限度檢查方法研究

楊淑先，趙新霞，牛坡（.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州市450003；.河南省人民醫(yī)院，鄭州市450003）

林可霉素利多卡因凝膠為外用半固體抗菌制劑，需要控制微生物限度。但由于該制劑中林可霉素為水溶性的抗菌成分，可抑制微生物的生長(zhǎng)，因此，不能通過常規(guī)法進(jìn)行該藥品的微生物限度檢查；另由于凝膠為水溶性的基質(zhì)，但具有一定的黏度，直接用薄膜過濾法也難以去除抗菌成分。因此，需建立合適的方法對(duì)該樣品進(jìn)行微生物限度檢查。筆者通過反復(fù)探索，經(jīng)多次試驗(yàn)，最終選用以0.05 mol·L－1的四硼酸鈉溶液[1]為稀釋劑，采用薄膜過濾法進(jìn)行本品的微生物限度檢查。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法有效、可行，可用于林可霉素利多卡因凝膠微生物限度檢查。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HTY-2000A集菌儀（杭州泰林醫(yī)療器械廠）；離心機(jī)（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；一次性使用薄膜過濾器（北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司）；PYX-DHS細(xì)菌培養(yǎng)箱、MJ-160B霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2 菌種

枯草芽孢桿菌 [CMCC（B）63 501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]均來源于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3 培養(yǎng)基[2]

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備[3]

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)22 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d，加入5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，再用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1 mL含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試品溶液的制備[1]

取樣品10 g，加0.05 mol·L－1四硼酸鈉溶液（85%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0）至100 mL，邊加邊研磨，使供試品充分乳化，作為1∶10供試品溶液。

2.3 回收率的計(jì)算[4]

試驗(yàn)組的加菌回收率（%）＝[（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]×100%；稀釋劑對(duì)照組加菌回收率（%）＝（稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)）×100%。

2.4 細(xì)菌檢查方法的驗(yàn)證

2.4.1 試驗(yàn)組[5]。取1 mL 1∶10供試品溶液，注入500 mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，薄膜過濾，用45℃、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗量為每膜1 000 mL。在最后一次沖洗液中加入含50～100 cfu的試驗(yàn)菌菌懸液1 mL，過濾后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

2.4.2 菌液組[6]。取1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的試驗(yàn)菌菌懸液，注入平皿中，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)。測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.4.3 供試品對(duì)照組。取1 mL 1∶10供試品溶液，注入500 mL、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，薄膜過濾，用45℃、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗量為每膜1 000 mL。過濾后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

2.4.4 稀釋劑對(duì)照組。取0.05 mol·L－1四硼酸鈉溶液1 mL，注入500 mL、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，薄膜過濾，用45℃、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進(jìn)行沖洗，沖洗量為每膜1 000 mL。在最后一次沖洗液中加入含50～100 cfu的試驗(yàn)菌菌懸液1 mL，過濾后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

上述各組培養(yǎng)后按規(guī)定方法計(jì)算菌落數(shù)，計(jì)算回收率；試驗(yàn)平行3次。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見表1，回收率結(jié)果見表2，其中供試品對(duì)照組均為無菌生長(zhǎng)（表1中菌落數(shù)為2個(gè)平皿的平均值）。

表1 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu）Tab 1Results of colony coun（tcfu）

表2 回收率測(cè)定結(jié)果（%%）Tab 2Results of recovery tests（%%）

由表1、表2結(jié)果可知，3次試驗(yàn)中細(xì)菌回收率均大于70%。

2.5 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.5.1 試驗(yàn)組。取1∶10供試品溶液和含50～100 cfu的試驗(yàn)菌孢子懸液各1 mL，分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)。

2.5.2 菌液組。取含菌數(shù)為50～100 cfu的試驗(yàn)菌孢子懸液1 mL，注入平皿中，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)。測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.5.3 供試品對(duì)照組。取1∶10供試品溶液1 mL，注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)。

2.5.4 稀釋劑對(duì)照組。取0.05 mol·L－1四硼酸鈉溶液和含50～100 cfu的試驗(yàn)菌孢子懸液1 mL，分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)。

上述各組培養(yǎng)后按規(guī)定方法計(jì)算菌落數(shù)，計(jì)算回收率；試驗(yàn)平行3次。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見表1，回收率結(jié)果見表2，其中供試品對(duì)照組均為無菌生長(zhǎng)（表1中菌落數(shù)為2個(gè)平皿的平均值）。

由表1、表2結(jié)果可知，3次試驗(yàn)中霉菌和酵母菌回收率均大于70%。

2.6 控制菌檢查方法的驗(yàn)證[7]

因樣品為一般外用制劑，根據(jù)微生物限度要求，控制菌只做金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢查。

2.6.1 試驗(yàn)組。取1∶10供試品溶液10 mL，注入500 mL、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，薄膜過濾，用45℃、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗量為每膜1 000 mL。在最后一次沖洗液中加入含10～100 cfu的銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌菌懸液1 mL，過濾后取出濾膜加至相應(yīng)的100 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)，依相應(yīng)菌的檢查方法進(jìn)行檢查。

2.6.2 陰性菌對(duì)照組。方法同“2.6.1”項(xiàng)，只是加入菌懸液換為大腸埃希菌。

菌檢結(jié)果見表3、表4（表中“+”表示菌生長(zhǎng)，“-”表示未見菌生長(zhǎng)）。

表3 銅綠假單胞菌控制菌驗(yàn)證方法試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of verification test for Pseudomonas aeruginosa

表4 金黃色葡萄球菌控制菌驗(yàn)證方法試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of verification test for Staphylococcus aureus

由表3、表4可見，試驗(yàn)組結(jié)果均為陽性，陰性菌對(duì)照組結(jié)果均為陰性，表明方法可行，結(jié)果符合要求。

3 討論

（1）微生物限度檢查法的方法學(xué)驗(yàn)證于2005年版《中國(guó)藥典》執(zhí)行以來，遇到了各種劑型的前處理問題，特別是具有抗菌活性的藥品，既要保證徹底除去抗菌物質(zhì)，又要注意所采用的方法對(duì)微生物的損傷程度[8]，因此，應(yīng)對(duì)所采用的必需的試劑進(jìn)行方法學(xué)的驗(yàn)證試驗(yàn)，保證所采用的方法為有效的方法。

（2）本品含量測(cè)定時(shí)采用高效液相色譜法，其含量測(cè)定供試液處理時(shí)既要通過薄膜過濾進(jìn)樣，又要保證林可霉素溶解完全通過濾膜。本試驗(yàn)借鑒了這種處理方法，達(dá)到既可過濾、又能使林可霉素通過濾膜去除其抑菌作用的優(yōu)點(diǎn)，從而使微生物在薄膜上有效截留，并對(duì)四硼酸鈉溶液的pH值進(jìn)行了控制，同時(shí)也證明在四硼酸鈉在本試驗(yàn)使用量下對(duì)微生物無毒性。

（3）在微生物限度檢查中，對(duì)于必須采用薄膜過濾法的品種，最大的困難是過濾速度較慢，因?yàn)槎鄶?shù)品種為非全溶性的品種，只能采取上清液進(jìn)行過濾。本品雖然為水溶性凝膠，但因凝膠的黏度嚴(yán)重影響過濾速度，因此，在分散凝膠的同時(shí)，選擇直徑較大的濾器，也是解決問題的有效途徑；另外也可采用溫度不超過45℃的沖洗液，降低黏度，提高沖洗速度。

（4）在微生物限度檢查中，對(duì)于沒有合適檢查方法的品種，要充分了解供試品的本身特性及處方組成[9]，甚至要了解有抗菌活性物質(zhì)的抗菌譜，才有助于選擇有效的方法，減少篩選的步驟[10]。本品中的林可霉素為抗細(xì)菌類抗生素，對(duì)真菌的抑制作用較弱，因此霉菌、酵母菌檢查方法可直接試用常規(guī)法。細(xì)菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)采用薄膜過濾法，所用的沖洗量筆者曾以300、500、800、1 000 mL進(jìn)行研究驗(yàn)證[11]，最后確定1 000 mL沖洗量可達(dá)到消除抑菌活性的作用，同時(shí)稀釋劑對(duì)照組菌回收率亦均超過70%。對(duì)于難過濾的品種，在過濾的同時(shí)進(jìn)行振搖，有助于提高過濾速度。

（5）微生物限度檢查時(shí)所采用的處理措施必須保證對(duì)微生物無毒性，本文所采用的四硼酸鈉溶液（0.05 mol·L－1）經(jīng)驗(yàn)證對(duì)微生物無毒性，可以作為前處理溶劑。

（6）對(duì)于抑菌活性較強(qiáng)的品種，又無理想的方法去除抑菌物質(zhì)，可以制備1∶20的供試液，降低抑菌物質(zhì)的濃度，增大接種體積，保證接種總量不變。但同時(shí)平皿培養(yǎng)基的量或者液體培養(yǎng)基的量應(yīng)相應(yīng)增加，以保證微生物的生長(zhǎng)環(huán)境。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）[S].第2冊(cè).2002：147.

[2] 王文麗，馬慶惠.藥品微生物限度檢查方法的影響因素及對(duì)策[J].中國(guó)醫(yī)療前沿，2007，2（17）：90.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅪJ.

[4] 李近磊，王嘉怡，遲丹怡，等.復(fù)方克林霉素凝膠微生物限度檢查法的方法驗(yàn)證研究[J].中國(guó)藥房，2010，21（25）：2 380.

[5] 李秋菲，唐振宏，張 芹，等.4種大環(huán)內(nèi)酯類藥物微生物限度檢查方法驗(yàn)證[J].中國(guó)藥業(yè)，2008，17（13）：20.

[6] 嚴(yán) 紅，薛 坤，張?jiān)碌?11種口服中成藥微生物限度檢查方法驗(yàn)證[J].中國(guó)藥房，2010，21（11）：1 029.

[7] 易大為，陳 野，潘 強(qiáng).薄膜濾過法在局部給藥制劑微生物限度檢查中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥事，2008，22（4）：342.

[8] 湯 楊.克霉唑口腔藥膜微生物限度檢查方法的建立[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，30（4）：27.

[9] 李凌云，邵紅燕.紅霉素眼膏微生物限度檢查方法的研究[J].中國(guó)藥事，2007，21（8）：614.

[10] 羅書香.藥品微生物限度檢查方法驗(yàn)證資料分析[J].中國(guó)藥事，2007，21（7）：525.

[11] 王海華，韋 濤.復(fù)方地塞米松乳膏微生物限度檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn) [J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，11（3）：47.