國(guó)產(chǎn)克霉唑乳膏微生物限度檢查方法研究及衛(wèi)生狀況評(píng)價(jià)

蔣受軍，劉濤，朱斌#，韋濤，黃橘，劉常凱（.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，南寧市5300；.桂林醫(yī)學(xué)院，桂林市 54004）

克霉唑具廣譜抗真菌活性，對(duì)表皮癬菌、毛發(fā)癬菌、曲菌、著色真菌、隱球菌屬和念珠菌屬均有顯著抑制作用?？嗣惯蛉楦酁槠つw科及婦科用藥類(lèi)非處方藥，用于體癬、股癬、手癬、足癬、花斑癬、頭癬以及念珠菌性甲溝炎和念珠菌性外陰陰道炎，為外用制劑，是2005年版《中國(guó)藥典》二部收載品種[1]。克霉唑?qū)φ婢幸种谱饔?，?duì)這類(lèi)具有抗菌活性的藥品進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)首先消除其抗菌活性，并通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證抗菌活性的去除是否徹底，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的有效性。《中國(guó)藥典》克霉唑乳膏標(biāo)準(zhǔn)正文中未收載微生物限度檢查方法，現(xiàn)按照2005年版《中國(guó)藥典》二部附錄ⅪJ微生物限度檢查法有關(guān)規(guī)定[1]，對(duì)克霉唑乳膏的微生物限度檢查方法進(jìn)行研究驗(yàn)證，并用建立的方法對(duì)全國(guó)各企業(yè)生產(chǎn)的克霉唑乳膏進(jìn)行微生物限度考察，以對(duì)國(guó)內(nèi)克霉唑乳膏產(chǎn)品的微生物污染狀況進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。結(jié)果，所建立方法適用性好；國(guó)產(chǎn)克霉唑乳膏衛(wèi)生狀況良好。

1 儀器與材料

1.1 儀器

D-53電熱恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder公司）；HHB11.600電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；HR1自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀（杭州訊數(shù)科技有限公司）；OLY生物顯微鏡（日本Olympus公司）；SG8酸度計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）；MLS-3780滅菌鍋（日本Sanyo公司）；無(wú)菌檢查薄膜過(guò)濾器（浙江寧海白石藥檢儀器廠）；生物安全柜（新加坡Esco公司）。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、0.7%蛋白胨水、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴代十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基均為北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品。

1.3 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]均由中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.4 藥品

克霉唑乳膏：來(lái)源于廣東順?lè)逅帢I(yè)有限公司、浙江盛基藥業(yè)有限公司、天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司、蕪湖三益制藥有限公司、廣州白云山制藥股份有限公司白云山何濟(jì)公制藥廠（以下簡(jiǎn)稱(chēng)何濟(jì)公制藥廠）等國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)共276批樣品，規(guī)格有1%、3%2種，具體情況詳見(jiàn)表1（批號(hào)略）。

表1 樣品來(lái)源、規(guī)格及批次Tab 1 Source，specification and batch number of samples

2 方法與結(jié)果

參照2005年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法試驗(yàn)[1]。

2.1 菌液的制備

接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫；吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試液的制備

取樣品10 g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液70 mL，混勻，加30 mL無(wú)菌吐溫-80，混勻，加入30 mL十四烷酸異丙酯萃取，取下層作為1∶10的供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查方法的建立及驗(yàn)證

2.3.1 計(jì)數(shù)檢查方法。①培養(yǎng)基稀釋法：取不同量供試液（1∶10）注皿，每皿分別加入1 mL驗(yàn)證菌菌液，注入15～20 mL不超過(guò)45℃的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，凝固，培養(yǎng)。如每皿注入0.5 mL，則為1∶20稀釋。

②薄膜過(guò)濾法：取1∶10供試液1 mL，加入100 mL pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，采用薄膜過(guò)濾法處理，0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液300 mL沖洗（每膜）。

2.3.2 敏感菌株及方法篩選。選取1批克霉唑乳膏按培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)行驗(yàn)證敏感菌株初步篩選。培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL）、薄膜過(guò)濾法加菌回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 2種方法回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of 2 kinds of recovery tests

采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL），結(jié)果3株細(xì)菌驗(yàn)證菌回收率均達(dá)到要求（大于70%）；白色念珠菌回收率為0，黑曲霉大于70%。由此表明：①克霉唑?qū)Π咨钪榫泻軓?qiáng)的抑制作用，為5種驗(yàn)證菌中對(duì)克霉唑最敏感菌株，方法篩選可采用該菌株進(jìn)行；②培養(yǎng)基稀釋法即可消除克霉唑?qū)?xì)菌的抑制作用，初步確定細(xì)菌計(jì)數(shù)可采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL）；③以白色念珠菌為試驗(yàn)菌，對(duì)薄膜過(guò)濾法進(jìn)行初步驗(yàn)證，結(jié)果回收率為97%，表明薄膜過(guò)濾法可消除克霉唑?qū)Π咨钪榫囊种谱饔?，初步確定霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)可采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行。

2.3.3 方法驗(yàn)證。以金黃色葡萄球菌、白色念珠菌為驗(yàn)證菌，選取國(guó)內(nèi)13家生產(chǎn)企業(yè)的各1批克霉唑乳膏為樣品，對(duì)初步確定的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 13家生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果Tab 3 Validation result of determination method for products from 13 manufacturers

表3結(jié)果表明，13個(gè)不同廠家樣品，細(xì)菌代表菌株金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL），回收率均大于70%；霉菌和酵母菌代表菌株白色念珠菌采用薄膜過(guò)濾法，回收率均大于70%。因此，克霉唑乳膏細(xì)菌計(jì)數(shù)方法采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL），霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法采用薄膜過(guò)濾法（沖洗量每膜300 mL）可滿足要求。

2.4 控制菌檢查方法的建立及驗(yàn)證

（1）常規(guī)法：分別取1∶10的供試液10 mL，加入100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌10～100 cfu，35℃培養(yǎng)24～48 h。取培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，35℃培養(yǎng)24～48 h，觀察其菌落形態(tài)。

（2）培養(yǎng)基稀釋法：培養(yǎng)基用量為300 mL，其他同常規(guī)法。

另取大腸埃希菌作為陰性對(duì)照試驗(yàn)菌?？刂凭?yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4（表中“/”表示未做）。

表4 控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Validation result of determination method for pathogenic bacteria

表4結(jié)果表明，采用常規(guī)法（培養(yǎng)基用量100 mL）進(jìn)行銅綠假單胞菌檢查方法成立?？嗣惯蛉楦鄬?duì)金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，需采用培養(yǎng)基稀釋法（培養(yǎng)基用量300 mL）進(jìn)行。

2.5 樣品微生物限度檢查

根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，確定細(xì)菌計(jì)數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL），霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)采用薄膜過(guò)濾法（沖洗量300 mL），金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（培養(yǎng)基用量300 mL），銅綠假單胞菌采用常規(guī)法（培養(yǎng)基用量100 mL），對(duì)276批國(guó)產(chǎn)克霉唑乳膏進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 276批樣品微生物限度檢查結(jié)果Tab 5 Results of microbial limit test of 276 batches of samples

由表5可見(jiàn)，對(duì)276批克霉唑乳膏進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果合格率99.3%；有2批樣品不合格，均為細(xì)菌計(jì)數(shù)不合格。

3 討論

3.1 供試液處理

對(duì)于部分乳膏、栓劑等非水溶性供試品，需采用吐溫、十四烷酸異丙酯等進(jìn)行乳化、萃取前處理，以分離乳膏基質(zhì)和藥用成分，提取污染菌，供試液制備過(guò)程相對(duì)復(fù)雜[2，3]?？嗣惯蛉楦嗷|(zhì)對(duì)供試品前處理影響較大，在制備供試液過(guò)程中，采用了吐溫-80作為表面活性劑、十四烷酸異丙酯對(duì)樣品進(jìn)行萃取以分離基質(zhì)和藥用成分、提取污染菌。由于各廠家處方、工藝的差異，不同廠家產(chǎn)品處理過(guò)程中，乳膏基質(zhì)的除去難易不等，一些樣品較容易實(shí)現(xiàn)分離提取，一些樣品則需要加熱才能有效溶解萃取；在進(jìn)行薄膜過(guò)濾時(shí)，一些樣品提取液仍堵塞濾膜，需減少每膜上樣量或進(jìn)行多次提取。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)的建立設(shè)想

經(jīng)對(duì)不同廠家的克霉唑乳膏檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，表明細(xì)菌計(jì)數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL）、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)采用薄膜過(guò)濾法（沖洗量每膜300 mL）、控制菌金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（培養(yǎng)基用量300 mL）、銅綠假單胞菌采用常規(guī)法（培養(yǎng)基用量300 mL）檢驗(yàn)均能滿足2005年版《中國(guó)藥典》對(duì)微生物限度檢查方法的要求。由于克霉唑乳膏具有抗菌作用，其微生物限度檢驗(yàn)方法如果不收入各論，則不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行該品種均要對(duì)方法進(jìn)行研究，易造成各實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法的差異以及不必要的重復(fù)工作。此次研究所建立的方法經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)各廠家產(chǎn)品的驗(yàn)證，具有良好的通用性，建議考慮收入克霉唑乳膏標(biāo)準(zhǔn)正文。

3.3 克霉唑乳膏微生物限度檢查結(jié)果分析

3.3.1 整體情況。采用建立的微生物限度檢驗(yàn)方法對(duì)抽驗(yàn)的276批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果2批樣品不合格，均為細(xì)菌計(jì)數(shù)超過(guò)規(guī)定限度，不合格率為0.7%。

3.3.2 樣品的真菌污染。雖然克霉唑乳膏為抗真菌藥，但樣品檢驗(yàn)結(jié)果顯示，部分樣品存在不同程度的真菌污染，其中一些樣品真菌污染較為嚴(yán)重，測(cè)定結(jié)果接近限度規(guī)定。樣品中檢出的真菌類(lèi)型基本為霉菌，從形態(tài)上分析主要有青霉、根霉、毛霉等。提示雖然克霉唑具廣譜抗真菌活性，但也不可能殺滅所有真菌，對(duì)一些真菌沒(méi)有殺菌作用或者僅為暫時(shí)的抑制作用，如果生產(chǎn)過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)不嚴(yán)格控制，都會(huì)造成產(chǎn)品的真菌污染?？嗣惯蛉楦酁橹委熣婢腥镜耐庥盟帲绻a(chǎn)品本身即存在較嚴(yán)重的真菌污染，給用藥者會(huì)帶來(lái)二次感染的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3.3 樣品的細(xì)菌感染。部分克霉唑乳膏存在細(xì)菌污染，細(xì)菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限度為不得超過(guò)1 000個(gè)/g[1]，而有2批不合格樣品細(xì)菌數(shù)分別為1 100 000、820 000個(gè)/g，嚴(yán)重超標(biāo)。

對(duì)2批不合格樣品的檢出菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示，2個(gè)樣品均為單一菌污染。分離得到的菌株分別采用涂片鏡檢、生化鑒定、分子生物學(xué)基因分型分析。結(jié)果，上述2批樣品污染菌均為洋蔥霍爾德菌。該菌為呼吸系統(tǒng)疾病的致病菌，感染性強(qiáng)、危害風(fēng)險(xiǎn)較大。2批不合格樣品為同一廠家產(chǎn)品，檢出菌鑒定顯示2批產(chǎn)品為相同微生物污染，提示該企業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)可能存在系統(tǒng)的污染來(lái)源。

3.3.4 嚴(yán)格控制微生物污染。由于克霉唑乳膏基質(zhì)相對(duì)較適合微生物存活，且效期較長(zhǎng)，在產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中帶入的微生物污染，在產(chǎn)品貯存、流通過(guò)程中，如果有適宜條件，一些特定微生物可能會(huì)大量繁殖，給用藥者帶來(lái)危害。因此，必須嚴(yán)格控制產(chǎn)品的微生物污染。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：236、附錄93-98.

[2] 王 進(jìn).環(huán)吡酮胺陰道栓微生物限度檢查方法研究[J].中國(guó)藥房，2008，19（28）：2 216.

[3] 盧文斌，郭瑜蓉.硝酸咪康唑乳膏微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證[J].海峽藥學(xué)，2009，21（9）：48.