去甲斑蝥素對(duì)裸鼠原位結(jié)腸癌的抑制作用

王嘉民 朱雯怡

（上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院普外科，上海 200125）

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，高侵襲性結(jié)腸癌因其惡性程度高、進(jìn)展速度快、轉(zhuǎn)移范圍廣，成為結(jié)腸癌致死的主要原因之一。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是我國(guó)傳統(tǒng)中藥斑蝥有效成分斑蝥素的衍生物。有研究提示，NCTD具有抑制腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤血管生成作用，但多集中于體外及動(dòng)物皮下實(shí)驗(yàn)，少有針對(duì)原位腫瘤的實(shí)驗(yàn)。我們以經(jīng)免疫缺陷小鼠體內(nèi)種植培養(yǎng)出的腫瘤組織作為移植源材，結(jié)合外科原位移植法構(gòu)建出裸小鼠人高侵襲性結(jié)腸癌模型，并通過(guò)NCTD的應(yīng)用，研究其是否有抑制體內(nèi)腫瘤的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

①腫瘤細(xì)胞。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HT-29，由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供，維持在含10%小牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)液中，用含0.25% Tyrosine和0.02% EDTA磷酸緩沖液獲取。②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。BALB/c nu/nu裸小鼠36 只，由上海腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供（滬動(dòng)132），雄性，鼠齡6～8 周，體質(zhì)量20g左右，在SPF（ specific pathogen free condition ）級(jí)條件下飼養(yǎng)。③注射用去甲斑蝥素（山東羅欣藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20052342）。

1.2 方 法

①裸鼠皮下移植瘤的建立和傳代。將含2×107mL癌細(xì)胞的細(xì)胞懸液0.2mL注射于裸鼠皮下。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至直徑15mm時(shí)，取材切成1.5mm小塊，再接種于下一代裸小鼠皮下，每代接種2只，接種到第4代。②人結(jié)腸癌組織塊裸小鼠原位種植瘤的建立。取第4代荷瘤裸鼠皮下移植瘤同時(shí)給20只裸鼠行原位種植。方法：處死皮下荷瘤裸鼠，皮膚消毒，取出皮下腫瘤，立即浸入含青霉素、鏈霉素各100U/mL的生理鹽水中；剔除周圍結(jié)締組織，取腫瘤生長(zhǎng)旺盛的組織，剪碎成1.5mm直徑碎塊，備用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以戊巴比妥鈉（45mg/kg）腹腔麻醉，皮膚消毒后腹正中切口進(jìn)腹，鉗出盲腸壁，于盲腸末端用針頭輕輕挑破漿膜面，用無(wú)齒鑷將盲腸末端向內(nèi)推壓，使局部腸壁形成凹龕。將直徑1.5mm的腫瘤組織塊塞入凹內(nèi)，并在瘤表面滴上一滴OB粘膠（醫(yī)用粘連劑，購(gòu)于廣州白云醫(yī)用膠總公司），使膠覆蓋瘤體表面，并鋪展至盲腸壁。待OB膠凝固（約50s）后，將盲腸回納腹腔，逐層關(guān)腹。術(shù)后精心飼養(yǎng)，定期觀察。整個(gè)手術(shù)過(guò)程遵循“無(wú)菌操作”及“無(wú)瘤操作”原則。③給藥方式。將已成瘤的20只荷HT-29移植瘤裸鼠，隨機(jī)分成2組：空白（無(wú)藥）對(duì)照組10只和NCTD（實(shí)驗(yàn)）組10只，另設(shè)一組無(wú)瘤裸鼠作為陰性（無(wú)瘤）對(duì)照8只。給藥方式：陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組相同，均以0.9%生理鹽水腹腔注射0.2mL（1次/2d，d1～d20）； NCTD 2mg/kg腹腔注射0.2mL（1次/2d，d1～d20）。兩種藥物于同一天，即接種腫瘤后第15天開(kāi)始給藥。④標(biāo)本采集。給藥后第21天以頸椎脫位法處死所有裸鼠，全面探查腹腔。完整剝離出原位移植瘤連同腫瘤胞膜組織，以電子天平秤秤取瘤重；用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體最長(zhǎng)徑與最短徑；計(jì)算各組腫瘤體積和抑瘤率。計(jì)算公式為：腫瘤體積（mm3）=長(zhǎng)徑×短徑2/2。抑瘤率（%）=（對(duì)照組瘤重－用藥組瘤重）/對(duì)照組瘤重×100%。收集組織標(biāo)本于-80℃保存?zhèn)溆谩＂萦^測(cè)指標(biāo)。原位腫瘤生長(zhǎng)情況：人結(jié)腸癌組織塊裸小鼠原位種植后，定時(shí)觀察裸小鼠全身狀況，運(yùn)動(dòng)情況，腹部體征。裸鼠被頸椎脫位處死后，全面探查腹腔。觀察結(jié)腸腫瘤原位生長(zhǎng)情況。腫瘤組織以10%甲醛固定、石蠟包埋，切片后HE染色，作病理學(xué)檢查。⑥統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包完成。P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠原位種植瘤肉眼觀察

結(jié)腸腫瘤原位種植后3周左右，于腹部可捫及質(zhì)地稍硬結(jié)節(jié)；5～6周時(shí)明顯增大。第6周探查腹腔，可見(jiàn)腸壁腫瘤均有生長(zhǎng)，腫瘤呈實(shí)性，黃白色，多為圓形或橢圓形，普遍向周圍組織浸潤(rùn)，切開(kāi)呈魚(yú)肉樣（圖1）。原位種植成瘤率為100%，腸壁腫瘤平均瘤重（0.64±0.10）g。

2.2 HE染色

組織切片表現(xiàn)為未分化癌，癌細(xì)胞多呈圓形、橢圓形，胞漿豐富，核大畸形、深染，核分裂相多見(jiàn)，呈彌漫性生長(zhǎng)。癌組織排列呈團(tuán)狀或索狀，無(wú)明顯腺體結(jié)構(gòu)存在，在腸壁中呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，癌細(xì)胞間有結(jié)締組織（見(jiàn)圖1-A、B）。

圖1 結(jié)腸癌原位種植瘤HE染色（A×100倍 B×400倍）

2.3 裸鼠原位種植瘤生長(zhǎng)情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組裸鼠未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)，飲食正常。各組裸鼠給藥前、后原位種植瘤的外觀、瘤體積、瘤重見(jiàn)表1。給藥前，處死荷瘤裸鼠大體解剖，可見(jiàn)陰性（無(wú)瘤）對(duì)照組無(wú)瘤生長(zhǎng)，其余兩組腫瘤附著于盲腸漿膜層生長(zhǎng)，給藥后，腫瘤較用藥前有不同程度的增大。各組裸鼠瘤體積在給藥前無(wú)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；用藥后與空白對(duì)照組比較，NCTD組的瘤體積和瘤重均顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組裸鼠給藥前后原位種植瘤的瘤體積和瘤重(±s)

表1 各組裸鼠給藥前后原位種植瘤的瘤體積和瘤重(±s)

與空白對(duì)照組比較，#P＜0.01

分組 用藥前 用藥后 抑瘤率(%)n 瘤重(g) n 瘤重(g) 瘤體積(mm3)空白對(duì)照組 2 0.04±0.01 6 0.22±0.05 0.06±0.01 0 NCTD組 2 0.04±0.01 6 0.08±0.02#0.03±0.01#63.63±18.22#

3 討 論

人類應(yīng)用斑蝥醫(yī)治疾病已有兩千多年的歷史，主要用于治療肝癌、食管癌及胃癌等，并有獨(dú)特的升高白細(xì)胞作用[1]?？拱┧幰种颇[瘤生長(zhǎng)的機(jī)理之一就是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道NCTD抑制肝癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。NCTD抑制人白血病HL-60細(xì)胞的增殖作用則與其抑制DNA復(fù)制、干擾細(xì)胞生長(zhǎng)周期、影響細(xì)胞分裂周期蛋白6的合成有關(guān)：NCTD還可使人膽囊癌GBC-SD種植瘤的S期細(xì)胞明顯減少[4]。本實(shí)驗(yàn)顯示NCTD在裸鼠體內(nèi)能抑制HT-29細(xì)胞原位種植瘤的增殖和生長(zhǎng)，可能與NCTD在抑制腫瘤細(xì)胞停留在某個(gè)分裂周期的機(jī)制有關(guān)。

[1]姚燕丹,林少芒.去甲斑蝥素的研究進(jìn)展及其與乳腺癌的關(guān)系[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊,2005,7(1):58-59.

[2]唐龍英,王昭梅,鄭欽岳,等.去甲斑鰲素對(duì)卵巢癌3AO和AO細(xì)胞的體外抑制作用[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,20(2):34-36.

[3]Chen YN,Cheng CC,Chen JC,et al.Norcantharidin-induced apoptosis is via the exra cellular signal regulated kinase and c-Jun-NH2-terminal kinase signaling pathways in human hepatoma HepG2 cellp[J].Br J Pharmacol,2003,140(3):461-470.

[4]范躍祖,趙澤明,陳春球,等.去甲斑蝥素對(duì)荷瘤裸鼠膽囊癌移植瘤增殖和凋亡的體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)[J].中華普通外科雜志,2005,20(7):438-441.