脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞增殖及VEGF表達(dá)的影響

王保忠

（山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科教研室，山西 大同 037000）

糖尿病心肌病變是糖尿病主要的心臟并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高，危害性大。 糖尿病心肌病變由Ruble等于1972年首先提出，作為一種獨(dú)立的糖尿病并發(fā)癥，是一種特異的心肌疾病，主要表現(xiàn)為心室舒張功能障礙。其病理改變主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、變性、灶性壞死，肌絲纖維大量丟失，心肌細(xì)胞外間質(zhì)有不溶性膠原蛋白積聚、纖維化，心肌細(xì)胞能量代謝紊亂、結(jié)構(gòu)異常、功能改變、凋亡增加，促使心肌纖維化的細(xì)胞因子和炎性因子異常表達(dá)，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。糖尿病心肌病是導(dǎo)致糖尿病死亡的主要原因之一[1]，延緩其病理進(jìn)程，對(duì)改善預(yù)后，降低病死率有重要的臨床意義。脂聯(lián)素（Adiponectin，ADPN）是最近發(fā)現(xiàn)的一種由脂肪細(xì)胞分泌的特異蛋白質(zhì)，有關(guān)數(shù)據(jù)顯示ADPN與胰島素抵抗有關(guān)，并具有抗炎和抗粥樣硬化作用。臨床和基礎(chǔ)研究均表明，脂聯(lián)素與心臟疾患發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)和滲透的分子。多項(xiàng)研究認(rèn)為糖尿病患者高血糖通過蛋白激酶C機(jī)制，促進(jìn)VEGF的表達(dá)而參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。許多研究顯示脂聯(lián)素在心力衰竭和心室重構(gòu)過程中起到重要作用[1,2]，具有心臟保護(hù)功能。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境中HCM增殖及VEGF表達(dá)的影響研究尚未見報(bào)道，本研究旨在探討高糖環(huán)境下脂聯(lián)素對(duì)HCM增殖及VEGF表達(dá)的影響，以揭示脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞的可能保護(hù)機(jī)制，從而為預(yù)防、治療糖尿病心肌病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人心肌細(xì)胞購(gòu)于北方偉業(yè)發(fā)展有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青），D-2葡萄糖、MTT試劑盒（美國(guó)Sigma公司），脂聯(lián)素Human gAcrp（Pep rotech），Trizol試劑（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），引物：上游5’-AAACACAGACTCGCG TTGCA-3’、下游3’-GCCTCGGCTTGTCACATCT-5’，內(nèi)參β-actin：上游5’-GGCACCCAGCACAATGAA-3’、下游3’-GGAAGGTGGACAGCGAGG-5’、探針FAMCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACG-BHQ1（上海超世生物科技有限公司提供）

1.2 人心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及分組

HCM培養(yǎng)于含10%胎牛血清、5.5mmol/L D-葡萄糖、100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，并置于含5%CO2的37°恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每3～4d用0.25%胰酶消化傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)成亞融合狀態(tài)時(shí)。取部分細(xì)胞以1×104/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，改用無血清DMEM培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化生長(zhǎng)24h后，棄上清液，將其分為正常對(duì)照組（5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液）、高糖組（30.0mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液）、脂聯(lián)素組 （30.0mmol/L+2.5μg/mLADPN的DMEM培養(yǎng)液），以備MTT用。剩余細(xì)胞換為無血清DMEM培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化生長(zhǎng)24h后，將其分為正常對(duì)照組（5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液）、高糖組（30.0mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液）、脂聯(lián)素組 （30.0mmol/L+2.5μg/mLADPN的DMEM培養(yǎng)液），用于實(shí)時(shí)定量PCR。

1.3 MTT法測(cè)HCM增殖

每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔，進(jìn)行培養(yǎng)，為排除營(yíng)養(yǎng)成分消耗對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生誤差于48h更換培養(yǎng)液一次。培養(yǎng)24、48、72h后進(jìn)行MTT檢測(cè)，每孔加入5mg/mL的MTT20μL，繼續(xù)孵育4h，吸取上清，每孔加入二甲基亞楓（DMSO）150μl，振蕩10min，于酶標(biāo)儀490nm處測(cè)吸光度（OD值）。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

①RNA提?。簵壣锨?，加入Trizol試劑提取各組RNA。②逆轉(zhuǎn)錄：反應(yīng)體系總體積為20μL，按照逆轉(zhuǎn)錄說明合成cDNA。③實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定：PCR反應(yīng)總體積為50μL，PE7700PCR擴(kuò)增儀上以其94℃預(yù)變性2min，94℃變性25s， 60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)結(jié)束。由PCR反應(yīng)曲線得到Ct值，通過2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)定量數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖

24、48、72h高糖組與正常對(duì)照組比較細(xì)胞增殖受抑制（P＜0.05）。在加入脂聯(lián)素后24、48、72h脂聯(lián)素組與高糖組比較細(xì)胞增殖增加，隨時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞增殖增加明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表1。

表1 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下HCM增殖的影響(OD值)(±s)(n=3 )

表1 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下HCM增殖的影響(OD值)(±s)(n=3 )

組別 24h 48h 96h對(duì)照組 0.4426±0.0516 0.5710±0.0356 0.7663±0.0076高糖組 0.3337±0.0265*0.2447±0.0040*0.1197±0.0133*高糖+脂聯(lián)素組 0.5233±0.0119#0.7170±0.0061#0.9747±0.0369#

2.2 VEGF表達(dá)的結(jié)果

24、48、72h高糖組與正常對(duì)照組比較VEGFmRNA表達(dá)均增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增加（P＜0.05）。24、48、72h脂聯(lián)素組與高糖組比較VEGFmRNA表達(dá)均明顯下降，且呈時(shí)間依賴性（P＜0.05），見表2。

表2 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下VEGFmRNA表達(dá)的影響(2-△△Ct值) (n=3)

3 討 論

糖尿病性心肌病是一種特異性的心肌病，是糖尿病的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，其典型病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大，心肌間質(zhì)增生及纖維化、心肌局灶性壞死、心肌血管壁增厚等。Braunwald等[3]認(rèn)為糖尿病心肌病的可能原因包括膠原和終末糖基化產(chǎn)物修飾的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白積聚，導(dǎo)致心肌的順應(yīng)性和舒張功能受損，心肌鈣調(diào)控異常，蛋白激酶-C（PKC）的激活，心臟自主神經(jīng)功能紊亂，基因突變等。病程早期以心臟舒張功能異常為主，后期收縮功能也受損，出現(xiàn)心力衰竭的臨床表現(xiàn)。其中，心肌細(xì)胞功能受損是糖尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。

VEGF 是一種糖蛋白，由2個(gè)分子量為17～22kD相同亞基經(jīng)過二硫鍵連接形成分子量為34～45kD 的同源二聚體。在多個(gè)組織、細(xì)胞中參與了纖維化的過程。在生理?xiàng)l件下，VEGF表達(dá)量很低，以維持機(jī)體內(nèi)正常的血管生長(zhǎng)、保持血管密度的生理穩(wěn)定。缺血、缺氧、糖基化終未產(chǎn)物、血管緊張素Ⅱ等是刺激VEGF分泌的重要因素[4]。Way等[5]發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌同工酶PKC活性增加，過度表達(dá)PKC-β2的PKC-β2轉(zhuǎn)基因大鼠表現(xiàn)出心肌病和心肌纖維化。隨纖維化的發(fā)展，特征性表現(xiàn)為結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的表達(dá)增加，Ⅳ型膠原和纖維結(jié)合素mRNA表達(dá)增加，CTGF單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子一起誘導(dǎo)心肌纖維化。

本研究結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞的增殖受到抑制，VEGF表達(dá)增加?？赡苁怯捎诟咛峭ㄟ^葡萄糖依賴性通路選擇性激活PKC，尤其是PKC-β1從而引起細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常而引起細(xì)胞凋亡和纖維化。Min等[6]通過對(duì)NF-кB途徑抑制檢測(cè)新生大白鼠心肌細(xì)胞中PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos表達(dá)，認(rèn)為高血糖可以通過PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起心肌細(xì)胞肥大。高糖還可激活p38MAKP，直接底物磷酸化AP-1、c-myc、c-jun等，調(diào)節(jié)基因表達(dá)[7]，促進(jìn)VEGF的增加和分泌。高糖致炎癥反應(yīng)細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，如VEGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）等，國(guó)外多項(xiàng)研究[8,9]一致認(rèn)為VEGF增多導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。

ADPN是近年發(fā)現(xiàn)的一種由白色脂肪組織分泌的蛋白產(chǎn)物，由位于3q27的apM1基因編碼，相對(duì)分子質(zhì)量約3×104，具有244個(gè)氨基酸殘基。正常情況下，ADPN的血漿濃度為5～30μg/mL，約占總血漿蛋白量的0.01%。其是一種具有對(duì)糖尿病保護(hù)作用的蛋白質(zhì)，多項(xiàng)研究證明其具有抗炎、抗纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種作用。國(guó)外實(shí)驗(yàn)研究，Yajing[10]等對(duì)雄性小鼠心肌細(xì)胞經(jīng)脂聯(lián)素干預(yù)后也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡減少，起到對(duì)糖尿病心肌保護(hù)作用。對(duì)多種細(xì)胞研究顯示[11]：在活體內(nèi)ADPN下調(diào)Bcl-2 基因的表達(dá)，同時(shí)也可能抑制NF-Kb以及上調(diào)VEGF的轉(zhuǎn)錄因子的激活。但目前對(duì)糖尿病心肌病研究較少，尤其脂聯(lián)素對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)的機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示加入脂聯(lián)素后阻斷了高糖對(duì)心肌細(xì)胞的損害，HCM增殖能力增加，VEGF表達(dá)明顯降低，并呈時(shí)間依賴性，提示脂聯(lián)素可能通過抗炎、抗纖維化作用直接或間接起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，為臨床應(yīng)用脂聯(lián)素治療糖尿病心肌病提供了理論依據(jù)。

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