巨分子肌酸激酶鑒定在心肌病鑒別診斷中的方法學探討

張西鳳 張厚毅 孟建博

（1 滕州市精神病醫(yī)院，山東 滕州 277500；2 滕州市中心人民醫(yī)院，山東 滕州 277500；3 滕州市鮑溝中心衛(wèi)生院，山東 滕州 277500）

巨分子肌酸激酶（巨CK）是一種CK同工酶與自身抗體的復合物，由于巨CK常表現(xiàn)為CK-MB活性假性增高，對臨床癥狀不明顯及原先有心肌缺血者易引起錯誤的判斷。隨著免疫抑制法和電泳法測定CK-MB的普及，巨CK的發(fā)現(xiàn)正不斷增加。目前文獻報道的巨CK鑒定方法，可以避免因免疫抑制法測定CK-MB時所造成的假陽性的發(fā)生，通常CK-MB約占總CK的30%以下，如果CK-MB值遠大于總CK的30%以上，甚至出現(xiàn)CK-MB≥總CK活性，而患者心電圖無改變，標本無溶血，應考慮有無巨CK或CK-BB的存在[1]。目前報道的巨分子肌酸激酶鑒定方法至少有5種[1]，瓊脂糖凝膠電泳 ，巨CK的活化能測定，熱失活試驗，CK-MB質(zhì)量檢測，免疫學方法和電泳結(jié)合進行測定。如果這5種方法全部同時應用到實際工作中，其實用性會受到限制。因此，我們在熱失活試驗的基礎上，對CK-MB活性連續(xù)檢測7d，對免疫抑制法測定CK-MB時無法避免的假陽性進行動態(tài)觀察，探討一條判斷CK-MB活性假性升高的簡便途徑。

1 資料與方法

1.1 病例資料

2010年1月至2010年11月，46例心電圖無改變，CK-MB/CK比值＞0.3的患者為觀察組，其中男20例，女26例，年齡44～70歲，平均年齡（53±12）歲。連續(xù)檢測CK-MB/CK7天，觀察CK-MB/CK動態(tài)變化；32例心肌梗死的患者為對照組，其中男14例，女18例，年齡42～69歲，平均年齡（51±12）歲，連續(xù)檢測CK-MB/CK比值7d，觀察CK-MB/CK動態(tài)變化。兩組年齡比較（P＞0.05）。

1.2 血清的采集與處理：

每隔24h采集患者早晨空腹靜脈血2mL一次，連續(xù)7d。血液采集應順利，不得有溶血，盡快分離血清，放清潔干燥試管內(nèi)，加塞，-20℃保存待檢。

儀器：OLMPUS AU2700全自動生化分析儀，試劑盒為原裝配備，嚴格按照試劑盒說明書要求的參數(shù)操作，每批次檢測均有高、低兩個質(zhì)控品對檢測結(jié)果進行質(zhì)量控制。連續(xù)檢測CK-MB/CK比值7d，觀察CK-MB/CK動態(tài)變化。

1.3 熱失活試驗

將血清置45℃20min，測定CK殘余活性。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

觀察組46例中有42例第7天CK-MB/CK比值仍＞0.3，熱失活試驗后第7天CK-MB/CK比值仍＞0.3，4例恢復正常。見表1。對照組32例心肌梗死的患者有30例發(fā)病后3d內(nèi)CK-MB/CK比值降至正常，熱失活試驗后第7天CK-MB/CK比值≤0.02，2例患者因為新的梗死發(fā)作持續(xù)升高，但CK-MB/CK比值均未超過0.25，7d內(nèi)也降至正常。見表2。

表1 觀察組46例患者血清CK-MB/CK結(jié)果比較（±s）

熱失活前每日間比較P＞0.05，熱失活后每日間比較P＞0.05，熱失活前后每日內(nèi)比較P＜0.05

檢測時間（d） CK-MB/CK比值 熱失活后CK-MB/CK比值1 0.59±0.03 0.41±0.02 2 0.52±0.02 0.42±0.03 3 0.61±0.03 0.40±0.02 4 0.53±0.02 0.41±0.02 5 0.57±0.02 0.40±0.02 6 0.58±0.03 0.42±0.02 7 0.56±0.02 0.43±0.03

表2 對照組32例患者血清CK-MB/CK結(jié)果比較（±s）

表2 對照組32例患者血清CK-MB/CK結(jié)果比較（±s）

熱失活前1、2日間比較P＜0.05，熱失活前3～7d間比較P＞0.05，熱失活后1～7d日間比較P＞0.01

檢測時間（d） CK-MB/CK比值 熱失活后CK-MB/CK比值1 0.22±0.01 0.02±0.01 2 0.23±0.01 0.01±0.01 3 0.06±0.02 0.01±0.01 4 0.04±0.01 0.02±0.01 5 0.05±0.01 0.01±0.01 6 0.06±0.01 0.01±0.01 7 0.04±0.01 0.02±0.01

3 討 論

文獻報道顯示自20世紀80年代初期 巨CK就已被發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)[1,2]，并引起國外學者的重視。國內(nèi)外相繼又有大量有關報道[3,4]。迄今報道的文獻均顯示巨CK2比其他同工酶分子量大，比巨CK1或游離CK同工酶有著較高的活化能，往往在惡性疾患患者血中出現(xiàn)。巨CK2通常不會在健康人血中出現(xiàn)，它與惡性腫瘤密切相關，可作為腫瘤標志物[5]。長征醫(yī)院鑒定了30例血清內(nèi)有巨CK2標本。其中經(jīng)病理證實為惡性腫瘤患者14人（肝細胞癌8例，乳腺癌2例，腦膜轉(zhuǎn)移癌1例，宮頸鱗癌1例，結(jié)腸癌2例且都有肝骨轉(zhuǎn)移）另有5例肝硬化者；還從130例年齡在6～15歲的心肌炎患者血清中檢出10例含巨CK2，所檢測出的30例血內(nèi)含有巨CK2的患者無1例是健康人，且巨CK的活性都占總CK活性30%以上，有的幾乎等于總CK活性。因此，對CK的活性檢測的影響不容忽視。

免疫抑制法測定CK-MB作為診斷急性心肌梗死或心肌損傷的特異性指標已在臨床廣為應用。檢測方法的原理是用抗體將M亞基抑制，測定B亞基活性，結(jié)果乘以2既為CK-MB活性。當血清中出現(xiàn)巨CK或CK-BB時，其對CK-BB影響機理是巨CK和CK-BB不被M亞基抗體抑制，其活性百分之百被測出，且還要乘2，因此就出現(xiàn)了CK-MB等于或高于總CK的現(xiàn)象[6]。在本文作者的研究中，根據(jù)巨分子酶的分子量較大，在體內(nèi)不易排出，也不易被巨噬細胞系統(tǒng)吞噬而降解，又因有較長的半衰期，在血中存留時間較長等特點，對檢測結(jié)果進行動態(tài)檢測，結(jié)合熱失活試驗，進行了比較、分析。

國內(nèi)外文獻報道的巨分子酶研究逐步深入，迄今文獻報道的巨分子酶分子結(jié)構(gòu)有以下幾種[7]：①酶與免疫球蛋白的復合物，如CK-BBIgG CK-MM-IgA等。常見的巨分子酶的免疫球蛋白是IgG和IgA.，IgM少見。②酶與其他蛋白質(zhì)的復合物，如LDH-β 脂蛋白。③酶亞基或酶分子間的聚合物，如CK-Mt聚合物，LDH-亞基自身復合物。巨分子酶的種類：CK、LDH、AMY、GGT、ALP 。

目前已建立的巨分子酶CK鑒定方法評價：①瓊脂糖凝膠電泳：肌酸肌酶同工酶含兩種亞基，M亞基和B亞基。肌酸肌酶由這兩種亞基組成的二聚體。3種不同的組成方式合成3種同工酶。MM型主要來自心肌和骨骼肌，MB型主要來自心肌，BB型主要來自中樞組織。每一種同工酶分子所帶電荷不同，在特定電泳條件下，電場中泳動率各不相同。瓊脂糖凝膠電泳，CK同工酶質(zhì)控血清可顯示3條區(qū)帶，CK-BB位于陽極側(cè)白蛋白區(qū)域，CK-MB位于中間α2或β球蛋白區(qū)域，CKMM位于陰極側(cè)γ球蛋白區(qū)域。而巨CK1遷移于CK-MM與CK-MB之間。巨CK2時位于CK-MM的陰極側(cè)。此方法需要電泳儀，光密度掃描儀，中間還要經(jīng)過漂洗，干燥等環(huán)節(jié)，操作步驟復雜，在基層應用受到限制。②巨CK的活化能測定：測定活化能的原理為酶的活性依賴于溫度。患者標本用免疫抑制法分別于25℃、30℃、37℃，測定非CK-M活性。正常對照按CK總活性分別測定以上3種溫度的CK活性。正常CK和巨CK1的酶活化能范圍為 45～65kJ/mol。巨CK2的酶活化能為80～140kJ/mol。此方法在研究領域有應用價值，應用于日常工作中其實用性和簡便性有待探討。③熱失活試驗：將血清置45℃ 20min，測定CK殘余活性，CM-BB和CK-BB幾乎完全失活，而巨CK不受影響。此方法簡便易行，但尚未由權威機構(gòu)確認為金標準的方法，因此我們認為應用時還需要另一種簡便易行的方法同時應用加以印證。④直接檢測CK-MB質(zhì)量：用單克隆抗體直接檢測CK-MB質(zhì)量或用雙位點單克隆抗體酶標法測定CK-MB真正含量。非CK-MB為陰性。但真正應用于臨床檢驗日常工作的市售商品試劑盒目前鮮見上市。⑤免疫學方法和電泳結(jié)合進行測定，同樣存在操作步驟復雜的問題。⑥CKMB活性連續(xù)檢測與熱失活試驗聯(lián)合檢測，這是我們探討設計的另一種方法。主要是對于心電圖無改變，而CK-MB活性高于CK活性30%以上的患者進行鑒別診斷?；颊咝碾妶D無改變這一前提，確保了本實驗患者的安全性。中小型全自動生化分析儀、恒溫水浴箱在基層醫(yī)院的普及，確保了檢驗設備的可用性。對于CK-MB活性高于CK活性30%以上的患者血清，置45℃20min，再測定CK殘余活性，前后進行比較。我們的實驗數(shù)據(jù)顯示，連續(xù)3天以上檢測足以判斷巨分子酶存在與否，又具有簡便性。見表1～表2。

本研究結(jié)果顯示：CK-MB/CK比值＞0.3的患者，比值升高持續(xù)超過7d，熱失活試驗CK-MB/CK比值仍然＞0.3，提示這種升高是假性升高，而不是所謂的心肌病導致的升高。對照組真正的心肌梗死患者，CK-MB/CK比值前2日內(nèi)升高，第3日降至正常，但是比值均未超過0.3，熱失活試驗后CK-MB/CK比值大幅下降至0.0～0.02，這是沒有巨分子酶影響才能出現(xiàn)的結(jié)果，發(fā)病前2dCK-MB/CK比值升高是真性升高。這與相關文獻的報道也是一致的[1]。4例CK-MB/CK比值＞0.3的患者，為何在觀察期內(nèi)恢復正常，尚需進一步探討。2例心肌梗死患者由于出現(xiàn)新的心肌梗死，所以CK-MB/CK比值持續(xù)至第7日才恢復正常。因此，我們考慮把CK-MB/CK比值0.3作為一個判斷界限，高于0.3，就做熱失活試驗驗證巨分子酶是否存在。本研究觀察組的結(jié)果顯示，符合率達91.3%（42/46）。

4 結(jié) 論

對于心電圖無改變，CK-MB/CK比值＞0.3的患者，動態(tài)檢測CKMB/CK3天以上，結(jié)合熱失活試驗，可判斷血清中有無巨分子肌酸激酶存在，是一種簡便易行的方法。

[1]王愛華,許紹輝,于嘉屏,等.巨肌酸激酶鑒定方法的建立及臨床應用[J].臨床檢驗雜志,2000,18(2):26-28.

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[7]王愛華,顧鵬飛,樊笑霞,等.巨分子酶在常規(guī)檢驗中的“干擾”及其鑒別方法[J].上海醫(yī)學檢驗雜志,2002,17(5):17-19.