• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    hPer3基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在慢性粒細(xì)胞白血病急變監(jiān)測(cè)中的臨床意義*

    2011-08-02 07:38:56李翊衛(wèi)王曄愷周吉航周世權(quán)方國(guó)安劉曉光
    中國(guó)病理生理雜志 2011年11期
    關(guān)鍵詞:反義細(xì)胞株甲基化

    李翊衛(wèi), 王曄愷, 周吉航, 周世權(quán), 方國(guó)安, 劉曉光

    (舟山醫(yī)院1檢驗(yàn)科,2細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,浙江 舟山 316004)

    慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一種起源于骨髓多能干細(xì)胞的惡性增殖性疾病,起病隱匿,一旦急變,治療困難,死亡率高[1,2]。因此,對(duì) CML 急變的早期監(jiān)測(cè)尤為重要。時(shí)鐘基因在宏觀上能作用于前下丘腦視上核影響生物鐘變化[3],在微觀上對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖分化存在密切影響[4,5]。但時(shí)鐘基因與白血病的報(bào)道不多,我們通過觀察CML急變中時(shí)鐘基因hPer3(human period 3)的表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化水平變化,并將hPer3基因轉(zhuǎn)染CML細(xì)胞株K562觀察對(duì)其的抑制和促凋亡作用,以明確hPer3基因在CML急變中的作用及檢測(cè)價(jià)值。

    材料和方法

    1 臨床資料

    收集我院2006年1月-2010年11月門診和住院CML患者骨穿標(biāo)本29例,抽取時(shí)間均為上午8:00 -10:00,瑞氏染色法鏡檢確定 FAB 分型[6],CML慢性期17例,男10例,女7例,中位年齡43(39-57)歲,CML加速期6例,男4例,女2例,中位年齡46(37-53)歲,CML急變期6例,男5例,女1例,中位年齡49(37-62)歲,以良性血液病組40例(均為缺鐵性貧血)為對(duì)照,樣本抽取時(shí)間同上,男21例,女19例,中位年齡37(18-62)歲,良性血液病組骨穿檢查均符合臨床指征,采用肝素抗凝針筒留取2-4 mL骨髓,-80℃冰箱保存。

    2 儀器和試劑

    DNA純化試劑盒和普通PCR擴(kuò)增試劑盒購自Promega,對(duì)苯二酚、亞硫酸氫鈉、氯仿、氫氧化鈉購自上海晶純?cè)噭┯邢薰荆珼NA marker購自廣州東盛生物科技有限公司,Trizol購自Invitrogen,CpG甲基轉(zhuǎn)移酶(CpG methyltransferase,M.SssI)購自北京NEB,pMD18載體試劑盒和熒光定量 PCR試劑盒(SYBR Green I)購自TaKaRa,小牛血清和 RPMI-1640培養(yǎng)液購自碧云天,K562細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。甲基化特異性-PCR引物:MSF正義鏈5'- CGGGAGTTTTGGGTATTCGC - 3',反義鏈 5'-CGACCCGACTAACTAAAACG-3',甲基化產(chǎn)物 182 bp;USF正義鏈5'-TGGGTGGTTGGGTGGGAGTTTTGGGTATTTGT -3',反義鏈 5'-AATCCAACACCAACAACCCAACTAACT AAAACA -3',非甲基化產(chǎn)物207 bp;熒光定量 PCR引物:hPer3正義鏈 5'-ACAAACAGAACCACAAGGCA -3',反義 鏈 5'-CGTCCATTTGTTGGCATTT -3',擴(kuò)增產(chǎn)物 94 bp;GAPDH正義鏈 5'-GACCTGACCTGCCGTCTA -3',反義鏈 5'- AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物148 bp;pcDNA3.1 -h(huán)Per3 PCR 引物:pcDNA3.1-h(huán)Per3正義鏈5'-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGC CCCGCGGG-GAAGCTCC -3',反義鏈 5'-CGGGCCCTCTAGACTC-GAGTTACG TTCGAACTTTATGCC-3';均由上海生工合成。hPer3質(zhì)粒模板由舟山同生生物科技有限公司協(xié)助構(gòu)建。凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司Universal Hood II型,凝膠成像分析軟件為Quantity One,普通 PCR 儀為 Roche Mycycle,熒光PCR儀為Roche Lightcycle。

    3 方法

    3.1 生物信息學(xué)分析 從MethDB數(shù)據(jù)庫中選取hPer3啟動(dòng)子中富含CpG島的-465~269位點(diǎn)區(qū)域利用ABI MethPrimer軟件設(shè)計(jì)甲基化引物:MSF正義鏈(-453~444),反義鏈(-281~301);非甲基化引物:USF正義鏈(-465~444),反義鏈(-269~301)。

    3.2 hPer3 mRNA 檢測(cè)

    3.3 hPer3基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)

    為加強(qiáng)日常的運(yùn)行與管理,保證工程的良性運(yùn)行,避免因職能設(shè)置混亂、相互扯皮及人員分工的不合理造成不應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)損失而影響日常的正常通水要求,應(yīng)建立健全各項(xiàng)規(guī)章制度、完善職能分工和搞好人員的優(yōu)化配置。

    ①hPer3和GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 用Trizol提取骨髓總RNA,鑒定完整性和純度,取5 μg總RNA冰上逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR,反應(yīng)體系25 μL:其中 DNA 模板 2 μL,10 μmol/L hPer3 或 GAPDH 熒光定量 PCR 引物各1 μL,5 ×PCR 緩沖液5 μL,加去RNA酶水補(bǔ)至25 μL,反應(yīng)條件:95℃ 10 min;95℃20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30 個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后,加入連接緩沖液5 μL、純化的目的片段4.5 μL、pMD18 -T 載體 0.5 μL,低速離心后于16℃連接過夜,將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后涂氨芐青霉素平板,挑取單菌落培養(yǎng)過夜,抽提其質(zhì)粒通過PCR鑒定陽性重組子,送上海生工公司測(cè)序確認(rèn)。

    ②實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將重組質(zhì)粒倍比梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品,用①中的cDNA進(jìn)行SYBR Green I熒光染料嵌合法檢測(cè),反應(yīng)體系參照試劑說明書,反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán),72℃ 10 min,利用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)樣品中目的基因和內(nèi)參照基因分別進(jìn)行定量,骨髓組織或白血病細(xì)胞株中hPer3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為hPer3基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)。

    歸一化的效果是將原始數(shù)據(jù)映射到[0,1]區(qū)間,之后用訓(xùn)練集對(duì)SVM進(jìn)行訓(xùn)練,最后用得到的模型來預(yù)測(cè)測(cè)試集分類標(biāo)簽.本文中選取能較好反映5種狀態(tài)的18名被試的總共300組典型數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集,再選取另外的200組數(shù)據(jù)作為測(cè)試集.設(shè)置5種交互狀態(tài)下類別標(biāo)簽分別為(0;1;2;3;4).

    ③結(jié)果判定 甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增有產(chǎn)物而非甲基化擴(kuò)增無產(chǎn)物為完全甲基化,甲基化引物和非甲基化擴(kuò)增都有產(chǎn)物為部分甲基化,甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增無產(chǎn)物而非甲基化擴(kuò)增有產(chǎn)物為無甲基化。完全和部分甲基化判定為甲基化陽性,無甲基化為甲基化陰性。

    ①“村兩委”成立公共衛(wèi)生委員會(huì),加強(qiáng)對(duì)村民“綠色生活”教育,提高村民環(huán)保意識(shí)。加強(qiáng)農(nóng)村環(huán)境衛(wèi)生綜合治理,制定衛(wèi)生公約,定期開展衛(wèi)生檢查和評(píng)定。對(duì)污染嚴(yán)重的鄉(xiāng)村企業(yè),由鄉(xiāng)(鎮(zhèn))政府下達(dá)限期整改、取締或關(guān)閉的通知。

    ②甲基化特異性PCR 以ddH2O為空白對(duì)照,用經(jīng)M.SssI處理后的基因組DNA為陽性對(duì)照。反應(yīng)體系25 μL,其中 DNA 模板 2 μL,10μmol/L 甲基化或非甲基化正反向引物各1 μL,5×PCR 緩沖液5 μL,加去離子水補(bǔ)至25 μL。95℃預(yù)變性15 min;94℃50 s,56 ℃ 40 s,72 ℃ 60 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min,完成擴(kuò)增反應(yīng),產(chǎn)物用2%的瓊脂糖電泳,凝膠成像儀紫外燈下觀察結(jié)果。

    ①組織DNA抽提和甲基化修飾 采用苯酚氯仿法抽提患者骨髓基因組DNA和細(xì)胞株基因組DNA,采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量測(cè)定吸光度,確定其純度。吸取4 μL基因組DNA至40 μL去離子水中,加10 μL 3 mol/L的氫氧化鈉,37℃孵育20 min,加入30 μL 10 mmol/L 的對(duì)苯二酚和520 μL 1.5 mol/L 的亞硫酸氫鈉,50℃孵育16 h,應(yīng)用DNA純化試劑盒純化回收,加入50 μL 1 mol/L的氫氧化鈉,室溫放置5 min終止修飾,無水乙醇沉淀離心回收,室溫干燥后加入20 μL去RNA酶水重懸,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    十幾年后,在一個(gè)陰霾的秋日里,我跟一位司機(jī)開大卡車去給一個(gè)鎮(zhèn)子拉活兒。那是一個(gè)彌望郁然、有山有水的鎮(zhèn)子,鎮(zhèn)子被一層薄薄的流霧纏繞著。

    ③MTT檢測(cè)K562細(xì)胞抑制率 收集②中細(xì)胞,各孔吸出培養(yǎng)液,PBS洗1次,吸棄,加培養(yǎng)液180 μL,實(shí)驗(yàn)終止前加5 g/L MTT 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;控干液體,每孔加DMSO 150 μL,96孔振蕩板低速混勻10 min。酶標(biāo)儀選擇波長(zhǎng)490 nm,測(cè)定各組各孔吸光度A值。生長(zhǎng)抑制率(IR)計(jì)算公式:IR(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。

    ①pcDNA3.1-h(huán)Per3質(zhì)粒構(gòu)建 hPer3質(zhì)粒模板PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后,重組克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒,并對(duì)pcDNA3.1-h(huán)Per3質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

    ②脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-h(huán)Per3質(zhì)粒參照試劑盒說明書經(jīng)LipofectamineTM試劑盒轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞,設(shè)空載pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h,每組設(shè) 6 復(fù)孔。

    3.4 hPer3轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株

    ④Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)凋亡 收集②中細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌棄上清,殘?jiān)?xì)胞收集至流式管。每管加10 μL Annexin V -FITC 和5 μL PI,避光靜置15 min,加300 μL預(yù)冷的PBS,振蕩混勻上機(jī)檢測(cè)其凋亡率。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    3.2.3 嚴(yán)格執(zhí)行消毒隔離 ①做好自我防護(hù):戴手套操作;有創(chuàng)治療時(shí)戴護(hù)目鏡;嚴(yán)格執(zhí)行六步洗手法。②做好銳器傷防范:注射車上放置剪刀并固定,以便在床旁及時(shí)處理一次性醫(yī)療廢棄物;醫(yī)師、護(hù)士、保潔工熟知銳器傷后的處理和上報(bào)流程;推廣使用安全型留置靜脈注射器,保護(hù)患者靜脈、保證患者休息、減少銳器傷的發(fā)生。③所有操作嚴(yán)格均按標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防技術(shù)操作原則進(jìn)行。④教會(huì)患者家屬處理污物的方法,如接觸疑為血液、體液污染物品需戴手套給予處理并及時(shí)洗手,所有被體液污染物品按醫(yī)療廢棄物處理,防止發(fā)生院內(nèi)外交叉感染的可能。

    采用SPSS 13.0軟件,對(duì) hPer3在 CML各階段和對(duì)照組的甲基化分布兩兩進(jìn)行χ2檢驗(yàn)(對(duì)1≤T<5且n≥40采用校正χ2檢驗(yàn)),對(duì)CML各階段hPer3 mRNA表達(dá)做單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn),對(duì)K562轉(zhuǎn)染后固定時(shí)點(diǎn)的pcDNA3.1組和pcDNA3.1-h(huán)Per3組抑制率做t檢驗(yàn),對(duì)K562轉(zhuǎn)染后固定時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組和 pcDNA3.1組、pcDNA3.1-h(huán)Per3組做單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

    結(jié) 果

    1 hPer3基因啟動(dòng)子在CML各階段的甲基化分布

    見圖1,對(duì)照組、CML慢性期、CML加速期和CML急變期中,hPer3啟動(dòng)子甲基化陽性率(例)分別為0%(0/40)、17.65%(3/17)、66.67%(4/6)和83.33%(5/6)。CML急變期和加速期甲基化陽性率均高于 CML慢性期,差異顯著(χ2=8.44,P <0.01;χ2=5.03,P <0.05),但與 CML 急變期和加速期差異無顯著(P>0.05);CML急變期、加速期和慢性期甲基化陽性率均高于對(duì)照組,差異顯著(χ2=29.29,P <0.01;χ2=21.41,P <0.01;χ2=4.33,P <0.05)。

    Figure 1.hPer3 promoter methylation rates in IDA group and different phases of CML groups.*P <0.05,**P <0.01 vs IDA group;▲P <0.05,▲▲P<0.01 vs CML chronic phase group.圖1 hPer3基因啟動(dòng)子在CML各階段和IDA組中的甲基化分布

    2 CML各階段hPer3 mRNA表達(dá)

    見圖2,對(duì)照組、CML慢性期、CML加速期和CML急變期中hPer3 mRNA表達(dá)為75.03±18.16、5.13±2.29、0.40±0.18和0.17±0.05。各組兩兩之間差異顯著(P<0.01)。

    3 K562細(xì)胞株hPer3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

    見圖2,K562細(xì)胞株中,hPer3啟動(dòng)子為完全甲基化狀態(tài),mRNA表達(dá)為0.05±0.03。

    Figure 2.hPer3 promoter methylation status in K562 cells.M:methylation;U:unmethylation;m:marker;1:M.SssI;2:K562 cells;3:ddH2O.圖2 K562細(xì)胞中hPer3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

    4 hPer3轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株

    4.1 MTT檢測(cè)K562細(xì)胞抑制率 見圖3,24 h、48 h、72 h、96 h 各時(shí)點(diǎn),pcDNA3.1 組抑制率分別為(1.3±0.3)%、(1.6±0.5)%、(1.3±0.5)%、(1.9±0.4)%;pcDNA3.1-h(huán)Per3組抑制率分別為(9.8±2.4)%、(29.1±5.1)%、(48.2±8.1)%、(63.4±10.5)%,各時(shí)點(diǎn)差異顯著(P<0.01)。

    Figure 3.Inhibitory rates of K562 cells detected by MTT.**P <0.01 vs pcDNA3.1 group.圖3 MTT檢測(cè)K562細(xì)胞抑制率

    4.2 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)凋亡 圖4、5結(jié)果顯示,24 h、48 h、72 h、96 h 各時(shí)點(diǎn),對(duì)照組凋亡率分別為(1.9±0.7)%、(2.6±0.8)%、(2.2±0.6)%、(2.8±0.9)%;pcDNA3.1組凋亡率分別為(2.4±0.8)%、(2.7±1.1)%、(2.5±1.1)%、(3.4±1.3)%;pcDNA3.1-h(huán)Per3組凋亡率分別為(7.4±2.3)%、(11.2±3.7)%、(16.9±4.5)%、(18.8±4.3)%。各時(shí)點(diǎn)pcDNA3.1-h(huán)Per3組凋亡率均高于對(duì)照組和pcDNA3.1組,差異顯著(P<0.01)。

    In this paper,the discriminator of the DLL is defined as:

    Figure 4.Apoptotic rates of K562 cells in control group,pcDNA3.1 group and pcDNA3.1 - hPer3 group.** P <0.01 vs pcDNA3.1 group or control group.圖4 各組早期凋亡率

    Figure 5.Apoptotic rates of K562 cells detected by AnnexinV/PI staining.圖5 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)凋亡

    討 論

    CML的發(fā)病率僅次于急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL),慢粒經(jīng)加速期轉(zhuǎn)入急變期過程中,約半數(shù)患者的轉(zhuǎn)變是逐漸發(fā)生的,但也有部分患者轉(zhuǎn)變迅速。國(guó)外有文獻(xiàn)認(rèn)為,CML患者長(zhǎng)期的酪氨酸激酶抑制劑治療引起CML患者骨髓白血病干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蓄~外特性的高級(jí)干細(xì)胞,這種高級(jí)干細(xì)胞引發(fā)了CML的急變并產(chǎn)生抗藥等不良后果[1]。CML慢性期出現(xiàn)進(jìn)行性貧血、發(fā)熱持續(xù)不退、脾臟進(jìn)行性腫大、出血傾向和骨骼疼痛、血象及骨髓象的改變等癥狀均預(yù)示有急變的可能。由于CML主要病因?yàn)锽CR-ABL融合基因的產(chǎn)生,對(duì)CML緩解程度的分子生物學(xué)檢測(cè)多以BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本水平進(jìn)行判斷。但本研究顯示,hPer3的表達(dá)水平也可能作為慢粒急變的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一,與Yang等[7]的研究結(jié)果基本一致。hPer3作為時(shí)鐘基因的一種,正常體內(nèi)雖存在一定程度的振蕩,但在從CML慢性期進(jìn)入加速期的變化幅度在1個(gè)數(shù)量級(jí)以上,遠(yuǎn)高于正常體內(nèi)的振蕩幅度[8],可能作為慢粒急變的早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。

    可見,帶借代意義的詞,之所以獲得了借代意義,從源頭上看,是由于人們?cè)谡J(rèn)知事物的過程中,不同的詞涉及多個(gè)不同角度的關(guān)聯(lián)性所使然。這種不同的角度在語言系統(tǒng)中又是相互依存、相互關(guān)聯(lián)的,沒有主次分別。不過,就其關(guān)聯(lián)的事物的類別而言,同類關(guān)聯(lián)和異類關(guān)聯(lián)還是有著性質(zhì)上的不同。也正因此,我們將這些不同的語義內(nèi)在聯(lián)系方式區(qū)分為同類理據(jù)和異類理據(jù)。從探求理據(jù)的角度看,同類理據(jù)要比異類理據(jù)相對(duì)容易一些。

    真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控途徑通常有轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平的調(diào)控等,啟動(dòng)子區(qū)域甲基化屬于轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的一種,如果CpG島的甲基化為引起轉(zhuǎn)錄效率降低,那么其轉(zhuǎn)錄效率一般和甲基化程度存在相關(guān)性,如Na等[9]用甲基化特異性PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR觀察45例非小細(xì)胞肺癌患者GADD45家族基因啟動(dòng)子甲基化和其 mRNA的關(guān)系,發(fā)現(xiàn) GADD45A、GADD45B和GADD45G 分別有1.4%、7.2%和31.6%的甲基化比率,其中GADD45G mRNA降低與甲基化存在顯著相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),hPer3啟動(dòng)子上的甲基化水平也隨著CML急變而升高,但在急變期和加速期間差異無顯著,可能和樣本例數(shù)過少有關(guān),并且在慢粒細(xì)胞株K562中也觀察到了hPer3啟動(dòng)子的完全甲基化狀態(tài)。因此CML中很可能是hPer3啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致了其基因的表達(dá)降低,某些去甲基化制劑5-雜氮-2'-脫氧胞苷誘導(dǎo) MEG-01凋亡[10]可能和恢復(fù)hPer3的表達(dá)有關(guān)。Yang等[7]通過5-雜氮 -2'-脫氧胞苷逆轉(zhuǎn)了K562細(xì)胞中hPer3啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)并誘導(dǎo)hPer3基因重新表達(dá),提示抑癌基因hPer3的激活可能是地西他濱治療惡性血液疾病的機(jī)制之一。我們通過轉(zhuǎn)染并在K562細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)hPer3,發(fā)現(xiàn)K562呈現(xiàn)凋亡和生長(zhǎng)抑制。有報(bào)道表明,hPer1參與了ATM-chk1/chk2的DNA損傷反應(yīng)通路,并預(yù)示可能作為一種腫瘤抑制因子[11],而孫成銘等[12]通過將hPer2轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中觀察到cyclin B1的降低引起的 G2/M期阻滯[2],這說明hPer3也可能通過類似機(jī)制作用于K562細(xì)胞,其表達(dá)缺失可能是慢粒表達(dá)的原因之一,但究竟hPer3的表達(dá)缺失是原發(fā)性還是繼發(fā)性引起的,值得進(jìn)一步研究。

    [1]Perrotti D,Jamieson C,Goldman J,et al.Chronic myeloid leukemia:mechanisms of blastic transformation[J].J Clin Invest,2010,120(7):2254 -2264.

    [2]鄒外一,許多榮,蘇 暢,等.慢性髓性白血病患者βcatenin的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)病理生理雜志,2010,26(4):709 -712.

    [3]James FO,Boivin DB,Charbonneau S,et al.Expression of clock genes in human peripheral blood mononuclear cellsthroughout the sleep/wake and circadian cycles[J].Chronobiol Int,2007,24(6):1009 -1034.

    [4]Fu L,Pelicano H,Liu J,et al.The circadian gene Period2 plays an important role in tumor suppression and DNA damage response in vivo[J].Cell,2002,111(1):41 -50.

    [5]Fu L,Lee CC.The circadian clock:pacemaker and tumour suppressor[J].Nat Rev Cancer,2003,3(5):350 -361.

    [6]張之南,沈 悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第2版.北京:科學(xué)出版社,1998.168 -218.

    [7]Yang MY,Chang JG,Lin PM,et al.Downregulation of circadian clock genes in chronic myeloid leukemia:alternative methylation pattern of hPer3[J].Cancer Sci,2006,97(12):1298-1307.

    [8]Boivin DB,James FO,Wu A,et al.Circadian clock genes oscillate in human peripheral blood mononuclear cells[J].Blood,2003,102(12):4143 -4145.

    [9]Na YK,Lee SM,Hong HS,et al.Hypermethylation of growth arrest DNA-damage-inducible gene 45 in nonsmall cell lung cancer and its relationship with clinicopathologic features[J].Mol Cells,2010,30(1):89 -92.

    [10]Schnekenburger M,Grandjenette C,Ghelfi J,et al.Sustained exposure to the DNA demethylating agent,2'- deoxy-5-azacytidine,leads to apoptotic cell death in chronic myeloid leukemia by promoting differentiation,senescence,and autophagy[J].Biochem Pharmacol,2011,81(3):364-378.

    [11]Gery S,Komatsu N,Baldjyan L,et al.The circadian gene Per1 plays an important role in cell growth and DNA damage control in human cancer cells[J].Mol Cell,2006,22(3):375-382.

    [12]孫成銘,黃世鋒,羅紅偉,等.鐘基因 Per2對(duì)白血病K562細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響及其機(jī)制研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(4):301-306.

    猜你喜歡
    反義細(xì)胞株甲基化
    認(rèn)識(shí)反義詞
    反義疑問句小練
    這山望著那山高
    穩(wěn)定敲低MYH10基因細(xì)胞株的建立
    Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
    穩(wěn)定抑制PAK2蛋白表達(dá)的HUH—7細(xì)胞株的建立
    鼻咽癌組織中SYK基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化分析
    胃癌DNA甲基化研究進(jìn)展
    CYP2E1基因過表達(dá)細(xì)胞株的建立及鑒定
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    婷婷色麻豆天堂久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 中国国产av一级| 亚洲va在线va天堂va国产| 干丝袜人妻中文字幕| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 伦理电影大哥的女人| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲av.av天堂| 丝袜美腿在线中文| 久久精品国产亚洲网站| 日韩一区二区视频免费看| 最近中文字幕2019免费版| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 在线免费十八禁| 又爽又黄a免费视频| 免费看光身美女| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产成人福利小说| 五月天丁香电影| 97在线人人人人妻| 99视频精品全部免费 在线| eeuss影院久久| 在线观看国产h片| 国产精品一区www在线观看| 国产综合懂色| 高清午夜精品一区二区三区| 美女国产视频在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 在线a可以看的网站| 在线观看一区二区三区| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产精品国产三级国产专区5o| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美日韩综合久久久久久| 少妇丰满av| av一本久久久久| 在线 av 中文字幕| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲欧洲国产日韩| 久久午夜福利片| av线在线观看网站| 亚洲av二区三区四区| 日韩伦理黄色片| 国产av国产精品国产| 日本黄色片子视频| 不卡视频在线观看欧美| 黄片wwwwww| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产乱人偷精品视频| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲伊人久久精品综合| 禁无遮挡网站| 成人美女网站在线观看视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品午夜福利在线看| 最近手机中文字幕大全| 欧美97在线视频| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品人妻久久久影院| 精品久久久精品久久久| 国产免费又黄又爽又色| 日本黄大片高清| 日韩三级伦理在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 国产综合懂色| 九九在线视频观看精品| eeuss影院久久| 毛片一级片免费看久久久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 尾随美女入室| 亚洲真实伦在线观看| xxx大片免费视频| 搡老乐熟女国产| 热99国产精品久久久久久7| 欧美一级a爱片免费观看看| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲美女视频黄频| 精品久久久精品久久久| 真实男女啪啪啪动态图| 成年女人看的毛片在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲最大成人手机在线| 中文字幕久久专区| 寂寞人妻少妇视频99o| 九色成人免费人妻av| 亚洲精品国产av成人精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 成年版毛片免费区| 日韩制服骚丝袜av| 麻豆成人午夜福利视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 一级a做视频免费观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 久久久久久久亚洲中文字幕| 天堂中文最新版在线下载 | 最后的刺客免费高清国语| 久久99热6这里只有精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 网址你懂的国产日韩在线| 26uuu在线亚洲综合色| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲不卡免费看| 看十八女毛片水多多多| 97超视频在线观看视频| 国产人妻一区二区三区在| 中文字幕久久专区| 日本午夜av视频| 一级片'在线观看视频| 久久久久九九精品影院| 美女视频免费永久观看网站| 免费av不卡在线播放| 久久国产乱子免费精品| 好男人视频免费观看在线| 亚洲av成人精品一区久久| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲国产精品专区欧美| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲图色成人| 99精国产麻豆久久婷婷| 啦啦啦在线观看免费高清www| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 天堂中文最新版在线下载 | 香蕉精品网在线| 国产高清三级在线| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 美女内射精品一级片tv| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 一个人看的www免费观看视频| 黄色配什么色好看| 色综合色国产| 欧美三级亚洲精品| 免费看a级黄色片| 精品国产三级普通话版| 亚洲av免费在线观看| www.色视频.com| 欧美精品国产亚洲| 18禁在线播放成人免费| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 女人被狂操c到高潮| 如何舔出高潮| .国产精品久久| www.色视频.com| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲三级黄色毛片| 久久久亚洲精品成人影院| 啦啦啦在线观看免费高清www| 毛片女人毛片| 亚洲av成人精品一区久久| 免费观看在线日韩| 精品久久久久久久久av| a级毛色黄片| 不卡视频在线观看欧美| 高清日韩中文字幕在线| 99久久精品国产国产毛片| av在线app专区| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 99视频精品全部免费 在线| 日韩精品有码人妻一区| 免费av毛片视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 少妇熟女欧美另类| 亚洲无线观看免费| 亚洲精品日韩av片在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久人人爽人人片av| 国产精品国产av在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 午夜视频国产福利| 国产爱豆传媒在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 亚洲四区av| 日日啪夜夜爽| 免费观看在线日韩| 久久精品综合一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美精品一区二区大全| 一级二级三级毛片免费看| 美女高潮的动态| 搞女人的毛片| 国产一区二区三区av在线| 久久6这里有精品| 超碰97精品在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产综合精华液| 久久精品夜色国产| 久久久a久久爽久久v久久| 精品久久久噜噜| 午夜视频国产福利| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美一级a爱片免费观看看| 伦精品一区二区三区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲av欧美aⅴ国产| 91狼人影院| 久久精品国产亚洲av涩爱| 欧美三级亚洲精品| 亚洲精品成人久久久久久| 国产黄a三级三级三级人| 欧美zozozo另类| 丝袜脚勾引网站| 亚洲av在线观看美女高潮| 在线精品无人区一区二区三 | 国产乱人偷精品视频| 网址你懂的国产日韩在线| 国产亚洲5aaaaa淫片| av一本久久久久| 三级国产精品片| 人人妻人人看人人澡| 丝袜脚勾引网站| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 成人一区二区视频在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲怡红院男人天堂| 国产av国产精品国产| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲第一区二区三区不卡| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产视频首页在线观看| 国产 精品1| 观看免费一级毛片| 国产欧美亚洲国产| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久影院123| 亚洲人与动物交配视频| 日本一本二区三区精品| h日本视频在线播放| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲欧美一区二区三区国产| 老女人水多毛片| 九九在线视频观看精品| 高清日韩中文字幕在线| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲在线观看片| 亚洲欧美精品专区久久| 好男人视频免费观看在线| 午夜免费男女啪啪视频观看| 美女国产视频在线观看| 乱系列少妇在线播放| 国产伦在线观看视频一区| 一区二区av电影网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲精品国产色婷婷电影| 直男gayav资源| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产成人免费无遮挡视频| 久久99热6这里只有精品| 国产欧美日韩精品一区二区| 一级毛片 在线播放| 国产视频内射| 永久网站在线| 国产免费视频播放在线视频| 波多野结衣巨乳人妻| 少妇丰满av| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人精品福利久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 91精品国产九色| 国产免费福利视频在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久韩国三级中文字幕| 秋霞伦理黄片| 中文字幕av成人在线电影| 大片免费播放器 马上看| 成人欧美大片| 一级片'在线观看视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲av免费高清在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 久久精品综合一区二区三区| av黄色大香蕉| 亚洲精品aⅴ在线观看| av国产精品久久久久影院| 久久久a久久爽久久v久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 大片免费播放器 马上看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 中国三级夫妇交换| 人妻系列 视频| 熟女电影av网| 日本爱情动作片www.在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲成人久久爱视频| 免费av不卡在线播放| 亚洲最大成人av| 国产乱人偷精品视频| 只有这里有精品99| 观看美女的网站| 老女人水多毛片| 精品国产三级普通话版| 欧美 日韩 精品 国产| 男的添女的下面高潮视频| 嫩草影院入口| 麻豆成人av视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产 一区 欧美 日韩| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 禁无遮挡网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 男女边吃奶边做爰视频| 久久精品国产亚洲网站| 国产免费一级a男人的天堂| 毛片一级片免费看久久久久| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产高清三级在线| 国内精品美女久久久久久| 亚洲内射少妇av| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 最近中文字幕2019免费版| 免费电影在线观看免费观看| 99久久精品国产国产毛片| 美女被艹到高潮喷水动态| 我的老师免费观看完整版| 精品久久久久久电影网| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品视频人人做人人爽| 一区二区三区精品91| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 青春草亚洲视频在线观看| 水蜜桃什么品种好| 看黄色毛片网站| 国产精品无大码| 男男h啪啪无遮挡| 最近最新中文字幕大全电影3| 永久网站在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 丰满乱子伦码专区| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美3d第一页| 色综合色国产| 99久久中文字幕三级久久日本| 一级毛片我不卡| 国产大屁股一区二区在线视频| 搞女人的毛片| 国产精品成人在线| 久久久久久国产a免费观看| 色视频www国产| 中文资源天堂在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 大片电影免费在线观看免费| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品一二三| 精华霜和精华液先用哪个| 一区二区三区四区激情视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 91久久精品电影网| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 少妇 在线观看| 日本一本二区三区精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 欧美bdsm另类| 国产亚洲精品久久久com| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩欧美精品v在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品一区二区三卡| 2021天堂中文幕一二区在线观| av女优亚洲男人天堂| .国产精品久久| 亚洲色图综合在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲欧美日韩东京热| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲丝袜综合中文字幕| 五月玫瑰六月丁香| 丝瓜视频免费看黄片| av播播在线观看一区| 韩国av在线不卡| 国产免费福利视频在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 美女被艹到高潮喷水动态| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美一区二区亚洲| 91精品国产九色| 国产av码专区亚洲av| 亚洲最大成人av| 国产日韩欧美在线精品| eeuss影院久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 日韩国内少妇激情av| 99久久中文字幕三级久久日本| 2021少妇久久久久久久久久久| 日韩国内少妇激情av| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日日啪夜夜爽| 久久久午夜欧美精品| 午夜福利视频1000在线观看| 伦精品一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲,一卡二卡三卡| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩伦理黄色片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 伊人久久精品亚洲午夜| 午夜激情久久久久久久| 久久久久网色| 亚洲,欧美,日韩| 免费电影在线观看免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久精品人妻少妇| 精品少妇久久久久久888优播| 联通29元200g的流量卡| 免费观看a级毛片全部| 日韩亚洲欧美综合| 高清视频免费观看一区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产有黄有色有爽视频| 午夜亚洲福利在线播放| 国产免费又黄又爽又色| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| av国产久精品久网站免费入址| 国产在线男女| 丰满乱子伦码专区| 秋霞伦理黄片| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 日韩av免费高清视频| 免费少妇av软件| 五月玫瑰六月丁香| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 麻豆国产97在线/欧美| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品久久久久久电影网| 久久久久久久国产电影| 国产精品成人在线| 91精品国产九色| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲人成网站在线播| 国产精品av视频在线免费观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 免费观看a级毛片全部| 伊人久久国产一区二区| 免费观看无遮挡的男女| 久久鲁丝午夜福利片| 嫩草影院精品99| 国产成人午夜福利电影在线观看| 18禁在线播放成人免费| 日本熟妇午夜| 久久综合国产亚洲精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一本久久精品| 身体一侧抽搐| 老司机影院成人| 国产成人精品久久久久久| 国产精品嫩草影院av在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 色婷婷久久久亚洲欧美| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美高清性xxxxhd video| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 中文在线观看免费www的网站| 国产成年人精品一区二区| 日韩视频在线欧美| 爱豆传媒免费全集在线观看| 青春草视频在线免费观看| 亚洲国产欧美人成| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 日本色播在线视频| 直男gayav资源| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产免费又黄又爽又色| 精品一区在线观看国产| 一个人看的www免费观看视频| 插阴视频在线观看视频| 成人毛片60女人毛片免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产精品熟女久久久久浪| 男的添女的下面高潮视频| 麻豆乱淫一区二区| 深夜a级毛片| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品成人在线| 中文字幕亚洲精品专区| 国产亚洲91精品色在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 丰满乱子伦码专区| 日本熟妇午夜| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲国产高清在线一区二区三| 婷婷色综合www| 亚洲精品aⅴ在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品国产三级国产专区5o| 日本午夜av视频| av女优亚洲男人天堂| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩一本色道免费dvd| 婷婷色av中文字幕| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲人成网站高清观看| 国国产精品蜜臀av免费| 在线精品无人区一区二区三 | 九色成人免费人妻av| 亚洲人成网站高清观看| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 午夜福利高清视频| 久久99热6这里只有精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲精品一区蜜桃| 国产一区亚洲一区在线观看| 免费av观看视频| 精品久久久精品久久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲av中文av极速乱| 99久久人妻综合| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美日韩综合久久久久久| 青春草国产在线视频| 一本色道久久久久久精品综合| 熟女av电影| 最后的刺客免费高清国语| 2021天堂中文幕一二区在线观| tube8黄色片| 一级毛片久久久久久久久女| 日本黄大片高清| 中文字幕亚洲精品专区| 最新中文字幕久久久久| 少妇的逼水好多| 一区二区三区四区激情视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美日韩视频精品一区| 成人综合一区亚洲| 久久影院123| 一个人看的www免费观看视频| 国产淫片久久久久久久久| av在线观看视频网站免费| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产黄a三级三级三级人| 搞女人的毛片| 亚洲综合精品二区| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美高清性xxxxhd video| 777米奇影视久久| 欧美+日韩+精品| 午夜亚洲福利在线播放| 五月开心婷婷网| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美日韩视频精品一区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 黑人高潮一二区| 伦精品一区二区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 日日啪夜夜撸| 伊人久久国产一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美日本视频| 大片免费播放器 马上看| 久久久亚洲精品成人影院| 内地一区二区视频在线| 久久人人爽人人爽人人片va| 看十八女毛片水多多多| 国产精品99久久99久久久不卡 | 一区二区三区精品91| 欧美成人午夜免费资源| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲成人久久爱视频| 日韩精品有码人妻一区| 成人一区二区视频在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 天堂中文最新版在线下载 | 国产男女超爽视频在线观看| 久久久久网色| 国产精品久久久久久精品电影| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产极品天堂在线| 性色avwww在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 99热全是精品|