低氧性腎間質(zhì)纖維化和游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠尾加壓素Ⅱ及其受體表達(dá)的影響*

毛孫忠，鄧 蔚，2，許芳芳，薛 峰，2，胡良岡，2，申屠楊萍，2，范小芳，2，龔永生，2△

(溫州醫(yī)學(xué)院1低氧醫(yī)學(xué)研究所，肺心病研究室，2機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)教研室，浙江 溫州 325035)

尾加壓素II(urotensin II，UⅡ)是迄今所知最強(qiáng)的縮血管活性肽［1］，UⅡ及其受體——G蛋白偶聯(lián)受體14(G－protein－coupled receptor 14，GPR14)分布廣泛，在腦、腎、心及肺等均有表達(dá)。新近研究發(fā)現(xiàn):UⅡ作為一種具有絲裂原作用的自分泌/旁分泌因子，參與了糖尿病性腎纖維化的進(jìn)程［2］;低氧可使機(jī)體UⅡ分泌增加［3］，而低氧是慢性腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，UⅡ與低氧性腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)通過(guò)降低循環(huán)UⅡ的含量對(duì)自發(fā)性高血壓具有降壓作用［4］，運(yùn)動(dòng)可否通過(guò)調(diào)節(jié)UⅡ/GPR14對(duì)低氧性腎間質(zhì)纖維化具有干預(yù)作用目前仍未明了。本研究旨在通過(guò)觀察慢性低氧性腎間質(zhì)纖維化大鼠UⅡ/GPR14的變化及游泳運(yùn)動(dòng)在其中的作用，以期為慢性低氧性腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制及防治提供新的思路。

材料和方法

1 慢性低氧性腎纖維化大鼠模型的制備及處理

清潔級(jí)雄性SD大鼠45只，體重300～350 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)均分成對(duì)照組、低氧組和游泳組。按以往的方法制備大鼠低氧模型［5］，低氧組與游泳組置于自制常壓低氧艙內(nèi)，艙內(nèi)吸入O2濃度9% ～11%，CO2濃度＜3%，每天8 h，連續(xù)7周。游泳組在低氧3周后，于每天進(jìn)艙2 h前進(jìn)行無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，每次1 h，每天1次，共4周。游泳池為自制的圓形不銹鋼桶，內(nèi)徑50 cm，水溫為(33±2)℃，水深65 cm。對(duì)照組置于艙外，自由呼吸空氣，其它飼養(yǎng)條件相同。

2 動(dòng)物處理

動(dòng)物飼養(yǎng)到規(guī)定時(shí)間后，用戊巴比妥鈉(35 mg/kg，ip)麻醉，行左頸總動(dòng)脈插管取血，分別置入含肝素及預(yù)冷含10%EDTANa2、抑肽酶抗凝的試管中，4000 r/min 4℃離心10 min，取上清液－70℃保存待測(cè)。放血處死動(dòng)物后，取左腎組織約100 mg，待測(cè)組織羥脯氨酸的含量;取右腎組織約100 mg提取總RNA，待測(cè)UⅡ mRNA和GPR14 mRNA水平。

每組隨機(jī)各取3只大鼠麻醉后，經(jīng)左心室行主動(dòng)脈插管，用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛各約500 mL先后灌注固定。開(kāi)腹，取右上半腎組織(橫切)置于4%多聚甲醛中進(jìn)一步固定24 h。按石蠟或冰凍切片技術(shù)要求取材、包埋、切片。

3 血液和腎勻漿指標(biāo)的檢測(cè)

化學(xué)比色法檢測(cè)血液尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，Scr)的含量;制備10%腎組織勻漿，化學(xué)比色法檢測(cè)腎組織羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，以上試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。ELISA法測(cè)定血漿UⅡ含量，試劑盒由Phoenix Pharm aceuticals Inc.提供。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

4 腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)的檢測(cè)

腎組織石蠟包埋切片，切片厚度約5 μm，苦味酸－酸性品紅(van Gieson，VG)染色觀察腎間質(zhì)纖維化情況(膠原纖維為鮮紅色)。試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供。

5 腎組織UⅡmRNA和GPR14 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

采用RT－PCR法檢測(cè)腎組織 UⅡ mRNA和GPR14 mRNA的表達(dá)水平。Trizol一步法制備大鼠腎組織總RNA。常規(guī)PCR法擴(kuò)增產(chǎn)物，UⅡPCR引物的上、下游序列分別為5'－GAG CAG ACA CCC AGC CAG ACT T－3'和5'－TGC CCA GTG AGA GCC TTC CT－3'(PCR產(chǎn)物為306 bp，退火溫度為60℃);GPR14為5'－GCC TGG CTT GGT CAT TGG G－3'和5'－GCA GAG TGT AGA GGA AGG GAT TGA TG－3'(PCR產(chǎn)物為293 bp，退火溫度為68℃);β－actin為5'－CTG AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC －3'和5'－ GTG CTA GGA GCC AGG GCA GTA ATC－3'(PCR產(chǎn)物為357 bp，退火溫度為68℃)，引物均由賽百盛基因有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物行1.25%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)凝膠成像儀(Gene Genius)分析結(jié)果，分別計(jì)算UⅡ和GPR14 mRNA/β－actin條帶吸光度的比值作為其mRNA的相對(duì)含量。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

6 腎組織UⅡ蛋白的定位

選擇右腎上半中部，應(yīng)用恒冷冰凍切片機(jī)橫位連續(xù)切片，厚約10 μm。免疫組織染色采用SP法，Ⅰ抗?jié)舛葹? mg/L，4℃過(guò)夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色顆粒沉積。用PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。每個(gè)標(biāo)本取3張切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)非重復(fù)視野，光鏡下觀察腎小球單位及其腎小管染色情況，進(jìn)行定位研究。Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測(cè)其平均吸光度值(absorbance，A)及累積吸光度值(IA)作為UⅡ蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 BUN、Scr、血漿UⅡ和腎組織Hyp含量的比較

低氧組Scr和BUN含量較對(duì)照組分別低18.5%和14.1%(均P＜0.05)，而游泳組與低氧組間無(wú)顯著差別。低氧組腎組織Hyp含量比對(duì)照組高42.9%(P＜0.01)，而游泳組較低氧組低26.1%(均P＜0.05)。低氧組血漿UⅡ含量較對(duì)照組高380.8%(P＜0.01)，而游泳組較低氧低42.6%(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組BUN、Scr、血漿UⅡ和腎組織Hyp含量的比較Table 1.Comparison of BUN，Scr，plasm UⅡ and Hyp in renal tissues in rats(.n=12)

表1 各組BUN、Scr、血漿UⅡ和腎組織Hyp含量的比較Table 1.Comparison of BUN，Scr，plasm UⅡ and Hyp in renal tissues in rats(.n=12)

*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs hypoxia group.

Group Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)Hyp(mg/g)UⅡ(μg/L)Control 57.2 ±11.0 10.55 ±1.60 0.408±0.045 2.13±0.67 Hypoxia 46.6 ±10.7* 9.06 ±1.47* 0.583±0.200＊＊ 10.24 ±1.27＊＊Swimming 42.7 ±7.0 8.75 ±0.71 0.431±0.039## 5.88 ±0.91##

2 腎組織UⅡmRNA和GPR14 mRNA表達(dá)的比較

低氧組腎組織UⅡ mRNA表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)104.5%，而游泳組較低氧組下調(diào)33.2%(均 P＜0.01);低氧組腎組織GPR14 mRNA較對(duì)照組上調(diào)35.4%(P＜0.01)，而游泳組與低氧組間無(wú)顯著差別(P ＞0.05)，見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組腎組織UⅡ和GPR14 mRNA表達(dá)的比較Table 2.Comparison of the mRNA expression of UⅡ and GPR14 in renal tissues of rats(.n=9)

表2 各組腎組織UⅡ和GPR14 mRNA表達(dá)的比較Table 2.Comparison of the mRNA expression of UⅡ and GPR14 in renal tissues of rats(.n=9)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs hypoxia group.

0.881 ±0.145 Control 0.337 ±0.041 0.593 ±0.022 Hypoxia 0.689 ± 0.035＊＊ 0.803 ± 0.073＊＊Swimming 0.460 ±0.034##

Figure 1.Results of RT－PCR for UⅡmRNA and GPR14 mRNA in renal tissues of rats.1:marker;2 ～ 4:control group;5～7:hypoxia group;8～10:swimming group.圖1 各組腎組織RT－PCR電泳結(jié)果

3 腎組織UⅡ蛋白表達(dá)的比較

免疫組化結(jié)果分析顯示低氧組腎組織UⅡ蛋白的A及IA值表達(dá)均較對(duì)照組明顯上調(diào)(P＜0.01)，而游泳組較低氧組明顯下調(diào)(P＜0.01)。光鏡下觀察顯示:對(duì)照組大鼠腎組織棕黃色顆粒主要見(jiàn)于腎皮質(zhì)的腎小管上表達(dá)，腎小球內(nèi)未見(jiàn)明顯表達(dá);低氧組腎組織棕黃色顆粒表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，腎皮質(zhì)的腎小管上表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，腎小囊囊壁和腎血管內(nèi)皮細(xì)胞層可見(jiàn)少量表達(dá);游泳組棕黃色顆粒表達(dá)明顯低于低氧組，腎皮質(zhì)的腎小管上表達(dá)較強(qiáng)。陰性對(duì)照細(xì)胞胞核及胞膜呈藍(lán)色，胞漿及整片組織呈淡藍(lán)色，見(jiàn)表 3、圖2。

表3 各組腎組織UⅡ蛋白含量的比較Table 3.Comparison of the protein expression of UⅡin renal tissues of rats(.n=12)

表3 各組腎組織UⅡ蛋白含量的比較Table 3.Comparison of the protein expression of UⅡin renal tissues of rats(.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs hypoxia group.

Group A IA Control 0.205 ±0.045 2353 ±541 Hypoxia 0.461 ± 0.030＊＊ 5232 ±493＊＊Swimming 0.299 ±0.031## 3422 ±525##

4 腎組織VG染色觀察結(jié)果的比較

光鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組腎血管及周?chē)?jiàn)少量鮮紅色染色，低氧組腎血管及周?chē)?jiàn)較多鮮紅色染色，即間質(zhì)細(xì)胞增生、膠原纖維明顯增多，游泳組腎血管及周?chē)r紅色染色面積較少，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Histopathological changes in renal tissues of rats(VG staining，×400).A:control group;B:hypoxia group;C:swimming group.圖3 各組腎組織病理學(xué)檢查

討 論

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是一組進(jìn)行性發(fā)展的慢性疾病，具有很高的死亡率和致殘率。腎間質(zhì)纖維化是CKD進(jìn)展到終末期時(shí)的共同病變過(guò)程，延緩或防止腎纖維化是防治CKD進(jìn)展的關(guān)鍵。低氧是慢性腎間質(zhì)纖維化發(fā)病重要的致病因素之一。有關(guān)低氧引起腎臟纖維化的機(jī)制目前尚不清楚，氧化應(yīng)激、血管活性物質(zhì)失衡、炎癥反應(yīng)、增殖與凋亡等多因子、多因素都與該病理生理進(jìn)程有關(guān)［6］。目前認(rèn)為促纖維化細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor β，TGF － β)、內(nèi)皮素1等，在其中起著非常重要的作用［7］。

UⅡ是迄今為止發(fā)現(xiàn)的收縮血管活性最強(qiáng)的多肽(較之前被認(rèn)為收縮血管活性最強(qiáng)的內(nèi)皮素－1還強(qiáng)6－28倍)。UⅡ及其受體GPR14在體內(nèi)分布廣泛，在心血管、腎臟、肺、神經(jīng)和內(nèi)分泌組織均有表達(dá)［8］。UⅡ可通過(guò)內(nèi)分泌、旁/自分泌的方式發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)心腦血管穩(wěn)態(tài)、水鹽平衡及炎癥免疫等具有重要的調(diào)節(jié)作用，參與了高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等疾病的進(jìn)程［9］。新近研究發(fā)現(xiàn)，UⅡ作為一種有絲裂原作用的自分泌/旁分泌的生長(zhǎng)因子，具有促細(xì)胞增殖和促細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)等效應(yīng)［10］，UⅡ是否參與低氧性腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程目前尚不清楚。羥脯氨酸是反映組織膠原含量的指標(biāo)，膠原堆積是腎纖維化的表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):慢性低氧大鼠腎臟組織羥脯氨酸含量較正常對(duì)照組顯著增高，VG染色顯示膠原纖維染色的強(qiáng)度和面積均明顯升高，同時(shí)血漿UⅡ含量顯著升高，腎組織UⅡ mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)，GPR14 mRNA的表達(dá)亦顯著性上調(diào)，提示UⅡ/GPR14參與了慢性低氧致腎臟纖維化的進(jìn)程。Zhang等［3］的研究也發(fā)現(xiàn)UⅡ與TGF－β介導(dǎo)的糖尿病性腎纖維化密切相關(guān)。

目前臨床上根據(jù)腎臟纖維化發(fā)病機(jī)制采取藥物干預(yù)方法，對(duì)延緩CKD的進(jìn)展、改善CKD預(yù)后取得了一定的療效，但仍有25%左右的CKD患者腎臟病變進(jìn)行性發(fā)展，因此改進(jìn)當(dāng)前單純藥物干預(yù)的治療方略尤顯重要。運(yùn)動(dòng)對(duì)腎臟功能的影響歷來(lái)為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)所重視。有研究表明，運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓具有降壓作用與其降低循環(huán)UⅡ含量有關(guān)［3］，運(yùn)動(dòng)對(duì)低氧性腎間質(zhì)纖維化是否具有干預(yù)作用、該干預(yù)作用是否與UⅡ/GPR14有關(guān)目前尚未明了。研究表明，適度的有氧運(yùn)功可改善腎功能，而劇烈運(yùn)動(dòng)可引起腎損傷，甚至出現(xiàn)急性腎衰竭［11］。關(guān)宇光等［12］發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可以降低血漿UⅡ含量，每天1 h無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練可使大鼠血漿UⅡ含量下降，而1次3%負(fù)重力竭游泳運(yùn)動(dòng)后血漿UⅡ含量卻顯著升高，故本實(shí)驗(yàn)大鼠每天游泳定為1 h無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)。另外，Scr和BUN是反映腎功能的常用指標(biāo)，急慢性腎功能衰竭時(shí)Scr和BUN均明顯增高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)該強(qiáng)度下的游泳組大鼠BUN和Scr含量與其它組別無(wú)明顯差異。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，游泳運(yùn)動(dòng)4周后，游泳組大鼠腎組織羥脯氨酸值較低氧組顯著降低，VG染色顯示膠原纖維染色強(qiáng)度及面積也明顯降低，提示長(zhǎng)期適度游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性低氧腎間質(zhì)纖維化具有防治作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，游泳組大鼠血漿UⅡ含量較低氧組顯著降低，腎組織UⅡmRNA和蛋白表達(dá)亦顯著下調(diào)，而GPR14 mRNA的表達(dá)2組間無(wú)顯著差異。有報(bào)道，運(yùn)動(dòng)可降低血漿UⅡ含量對(duì)自發(fā)性高血壓具有降壓作用［4］，提示適度游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性低氧腎間質(zhì)纖維化的防治作用與降低循環(huán)UⅡ含量和改善腎組織UⅡ的表達(dá)有關(guān)。長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)后，循環(huán)中UⅡ含量的降低一方面可通過(guò)降低UⅡ?qū)ρ艿闹苯邮湛s作用和改善縮/舒血管活性物質(zhì)失衡［8］，進(jìn)而促進(jìn)腎臟血供，緩解腎缺血缺氧癥狀;另一方面減弱UⅡ促增殖作用及對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的促絲裂原作用，改善腎臟組織促纖維化細(xì)胞因子與抗纖維化細(xì)胞因子(如間質(zhì)金屬蛋白酶－2)間的失衡，緩解腎上皮細(xì)胞間質(zhì)化和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的發(fā)生［7］，進(jìn)而延緩腎纖維化的進(jìn)程。今后可以通過(guò)或配合與UⅡ生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)的拮抗劑來(lái)達(dá)到強(qiáng)化防治低氧性腎間質(zhì)纖維化的效果，有待進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:慢性低氧性腎纖維化大鼠UⅡ及其受體的表達(dá)上調(diào);適度游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性低氧腎間質(zhì)纖維化具有防治作用，并下調(diào)UⅡmRNA與蛋白的表達(dá)，推測(cè)該作用可能與調(diào)節(jié)UⅡ的表達(dá)有關(guān)，但尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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