HPLC法測定益母草顆粒（無蔗糖型）中鹽酸水蘇堿的含量

李政海 ，蘇作林 ，廖展葦 ，阮碧芳

1.美國東方生物技術(shù)有限公司，廣東深圳 518034；2.廣西靈峰藥業(yè)有限公司，廣西賀州 542800

益母草顆粒是由益母草單味藥材經(jīng)提取精制而成，用于血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后惡露不絕；經(jīng)量少、淋漓不凈、產(chǎn)后出血時間過長；產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全見上述證候者[1]。益母草顆粒原收載于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第七冊141頁，現(xiàn)已收載入2010年版《中國藥典》一部，為蔗糖型顆粒。有報道顯示，無蔗糖型的益母草顆粒，擴大了肥胖癥、高血壓、高血脂、糖尿病等忌糖患者的應(yīng)用范圍，給臨床用藥更多的選擇。其制劑中的鹽酸水蘇堿的含量可以采用HPLC-ELSD法[2-3]來測定，但該方法用到蒸發(fā)光散射檢測器，需控制霧化器溫度，漂移管溫度以及氣體（氮氣）流速，因此操作復(fù)雜。筆者在總結(jié)以往經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，采用HPLC-UV法測定無蔗糖型的益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含量。結(jié)果表明，本文所用方法快速簡便，分離度高，并具有良好的重復(fù)性，可用于益母草顆粒（無蔗糖型）的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

沃特斯2695-2487高效液相色譜儀；SPD-10A-VP紫外可見檢測器；AB265-S 電子天平（Mettler Toledo）；SG8200HBT超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸水蘇堿（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110712-200508）；益母草顆粒（無蔗糖型）（廣西靈峰藥業(yè)有限公司提供，批號：061001、071201、071202、071203）；乙腈、自制雙蒸水、甲醇、氨水均為分析純或色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗前處理

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate Column XB-NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；氨基鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈-水（90∶10）；流速為 1.0 ml/min；柱溫為 25℃；檢測波長為 192 nm[4-5]；進樣量為10 μl。理論板數(shù)按鹽酸水蘇堿峰計算不低于2000。

2.1.2 樹脂預(yù)處理方法 將新鮮樹脂浸泡在蒸餾水中1～2 d，使它充分膨脹后裝在層析柱中，先用樹脂體積20倍量的2 mol/L鹽酸，以每分鐘每平方厘米1毫升的流速進行交換，使其變?yōu)闅湫?，然后用水洗至流出液呈中性。接著再用樹脂體積10倍量的1 mol/L氫氧化鈉進行交換，使其恢復(fù)鈉型，用蒸餾水洗至流出液不含鈉離子，再重復(fù)一次鹽酸和氫氧化鈉的處理。最后用樹脂體積10倍量的1 mol/L的鹽酸進行交換，使它變?yōu)闅湫?，蒸餾水洗至中性即可。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 取鹽酸水蘇堿對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并制成1 ml含鹽酸水蘇堿1 mg的溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取益母草顆粒（無蔗糖型）適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，加熱水15 ml使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH至1～3，加于已處理好的強酸性陽離子交換樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，高10 cm）上，用水洗脫至流出液無色，棄去水液。再用甲醇-氨水（7∶3）150 ml洗脫（流速為 1 ml/min），收集甲醇-氨水洗脫液，蒸干。殘渣加流動相溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例稱取除益母草外的糊精、阿司帕坦，混勻，并制成不含益母草的陰性制劑樣品，再取制備好的陰性制劑樣品，同“2.2.2”項下供試品溶液方法制備，得陰性樣品溶液。

2.3 流動相的確定及專屬性試驗

參照文獻[6-8]，選用乙腈-水為流動相，經(jīng)試驗，選用乙腈-水（90∶10）時，樣品峰形對稱，理論板數(shù)按水蘇堿峰計算不低于2000。分別吸取以上三種溶液（對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液）各10 μl，一次進樣，色譜儀繪制色譜圖，見圖1。結(jié)果表明采用此方法鹽酸水蘇堿之外的其他組分對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

取鹽酸水蘇堿對照品，精密稱定96.4 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液50 m（濃度 1.928 mg/ml）， 用移液管分別精密量取 0.5、2.0、4.06.0、8.0 ml，分別置于10 ml容量瓶中，加流動相乙腈-水（90∶10）至 10 ml，搖勻，精密吸取上述 5 種溶液各 10 μl，注入液相色譜儀，測定。以色譜主峰面積A對鹽酸水蘇堿進樣量濃度 C（μg）進行回歸分析，得回歸方程 A=152158C 33647，r=0.9993。表明益母草顆粒中的鹽酸水蘇堿進樣量在 0.964～15.424 μg 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。l、+

2.5 精密度試驗

用移液管量取1.1568 mg/ml鹽酸水蘇堿對照品溶液，重復(fù)進樣6次。結(jié)果鹽酸水蘇堿峰面積平均值為1712576，RSD為1.48%，表明儀器的精密度符合要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別在棕色容量瓶室溫放置0、2、4、6、8 h時，按上述方法分別測定峰面積，結(jié)果鹽酸水蘇堿峰面積平均值為1118851，RSD為0.73%，表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.7 重復(fù)性試驗

取批號061001樣品，同上述供試品溶液的制備方法制備6份溶液，同法進樣、測定，計算含量，統(tǒng)計RSD，結(jié)果鹽酸水蘇堿平均含量為13.46 mg/g，RSD為1.69%，提示此測定方法的重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗

圖1 HPLC色譜圖

取批號061001樣品0.25 g，精密稱定，精密加入鹽酸水蘇堿對照品的水溶液3.0 ml，精密加入熱水15 ml，按供試品制備方法制備供試品溶液6份，依法測定，計算回收率。結(jié)果顯示鹽酸水蘇堿平均回收率為97.7%（RSD=1.23%，n=6），表明此方法回收率較好。見表1。

表1 益母草顆粒（無蔗糖型）中鹽酸水蘇堿回收率的測定結(jié)果（n=6）

2.9 樣品測定

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按本文色譜條件，測定3批樣品中鹽酸水蘇堿，同法計算含量。見表2。

表2 益母草顆粒（無蔗糖型）中鹽酸水蘇堿的測定結(jié)果（n=3）

3 討論

提取方法曾參照2005年版《中國藥典》一部第204頁益母草藥材含量測定方法，選用乙醇為溶劑進行加熱回流提取1.5 h。具體方法如下：取本品，研細，取約0.5 g，精密稱定。置于具塞錐形瓶中，加入乙醇50 ml，加熱回流1.5 h，冷卻，濾過，殘渣用乙醇50 ml分次洗滌，濾過，合并濾液，蒸干。殘渣用90%乙腈適量溶解，置10 ml量瓶中，定容至刻度，搖勻，過微孔濾膜（0.45 μm），即得。依法檢測其鹽酸水蘇堿含量。結(jié)果顯示該方法提取不完全，故未采用。

研究中曾擬修訂本品總生物堿的含量測定方法[1]，但試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)難以解決活性炭對生物堿的吸附問題，故未將總生物堿測定列入本品的質(zhì)量控制指標。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:289-290.

[2]馮旭,杜成智,梁臣艷.HPLC-ELSD測定益母顆粒中鹽酸水蘇堿的含量[J].中成藥,2008,30(5):37-38.

[3]聶金媛,何燕.HPLC-ELSD法測定產(chǎn)婦安膠囊中鹽酸水蘇堿的含量[J].海峽藥學,2010,22(3):56-57.

[4]唐德智.益母草及其制劑中鹽酸水蘇堿含量測定研究[J].中國民族民間醫(yī)藥,2010,19(17):56-58.

[5]閆冰.HPLC測定益母草流浸膏中鹽酸水蘇堿的含量[C].中華中醫(yī)藥學會中藥炮制分會2009年學術(shù)研討會論文集,2009:330-332.

[6]任江劍,徐建中,王志安.HPLC法測定鮮益母草中鹽酸水蘇堿含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2006,17(3):216-218.

[7]張韻,黃瑞紅,何桂區(qū).HPLC法測定安坤益母草片中鹽酸水蘇堿的含量[J].廣東藥學院學報,2008,84(1):16-17.

[8]嚴優(yōu)芍,李衛(wèi)民.HPLC法測定益母草分散片中鹽酸水蘇堿的含量[J].廣東藥學院學報,2006,22(6):604-606.