丙泊酚對(duì)血管緊張肽Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大及ROS/JNK1/2通路的影響

周武，張俊峰，王濤

(1.湖北省新華醫(yī)院麻醉科，武漢 430015;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030)

心肌細(xì)胞肥大是高血壓等多種常見心血管疾病的并發(fā)癥，其發(fā)展可加重心肌組織缺血缺氧狀態(tài)，增加猝死發(fā)生率;降低心室順應(yīng)性，并影響心肌細(xì)胞間力的產(chǎn)生與傳輸，終致心律失常及不可逆心力衰竭［1］。血管緊張肽 Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)可促進(jìn)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，活化 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-teminal kinase1/2，JNK1/2)，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及體積增大等心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)［2-3］?，F(xiàn)有研究提示在危重患者體內(nèi)血管緊張肽系統(tǒng)活性上調(diào)［4］。丙泊酚(propofol，Pro)被廣泛應(yīng)用于危重患者手術(shù)中的持續(xù)靜脈鎮(zhèn)靜。作為一種抗氧化劑，丙泊酚能拮抗活性氧導(dǎo)致的多種細(xì)胞損傷，具有一定的心肌保護(hù)作用［5］。但其是否能抑制心肌肥大，尚未可知。筆者在本研究擬探討丙泊酚對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 1～2 d齡新生Wistar乳鼠，購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2004-0007。

1.1.2 試劑與儀器 AngⅡ(Sigma公司)、丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品由德國費(fèi)森尤斯公司惠贈(zèng)、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco＇s modified eagle＇s medium，DMEM)干粉培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清(Gibco公司)，［3H］-亮氨酸(中科院上海原子能研究所)，硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC 膜，Amersham 公司)，小鼠抗大鼠JNK1/2單克隆抗體及增強(qiáng)熒光顯示劑(Santa Cruz公司)。其余試劑為國產(chǎn)分析純。垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Biorad公司)。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)及分組 1～2 d齡新生Wistar乳鼠置于超凈工作臺(tái)上，常規(guī)取心室肌，用D-Hanks液于4℃漂洗，剪成1mm3體積碎塊，0.1%胰酶消化成細(xì)胞懸液，差速貼壁1 h后，將心肌細(xì)胞用含20%胎牛血清及青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液稀釋后，均勻接種于6孔板，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，換無血清培養(yǎng)液。參考文獻(xiàn)［6］所用濃度，按給予培養(yǎng)基中試劑的不同分為如下幾組:①對(duì)照組，給予培養(yǎng)基;②Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)組;③AngⅡ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)組;④Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)組;⑤Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)組。

1.2.2 相差顯微鏡下觀察細(xì)胞直徑 含各種濃度干預(yù)因素的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。相差顯微鏡觀察并攝相，隨機(jī)取6個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞直徑，并與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。

1.2.3 ［3H］-亮氨酸摻入率測(cè)定 參考文獻(xiàn)［7］方法。細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，加入各組處理因素及［3H］-亮氨酸18.3 kBq繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗2次，0.25%胰酶消化后收集于玻璃纖維素膜，10%三氯乙酸固定，濾膜烘干后用LS3810液體閃爍儀測(cè)定樣品的每分脈沖數(shù)(cpm)。結(jié)果以對(duì)照組細(xì)胞［3H］-leucine摻入率作100%，各組均以［3H］-leucine摻入百分率表示。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi) ROS水平分析 參考文獻(xiàn)［8］方法。在細(xì)胞培養(yǎng)第4天，D-Hanks液洗細(xì)胞1次，以DCFHDA(5 μmol·L-1)在37℃下避光孵育30 min。各組處理30 min后，PBS漂洗2次，并以0.25%胰酶消化細(xì)胞。熒光分光光度計(jì)在激發(fā)光波長485 nm、發(fā)射光波長535 nm下觀察細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光強(qiáng)度的變化，反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.2.5 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶活性(NADPH oxidase，Nox)測(cè)定 參考文獻(xiàn)［9］方法。胰酶消化細(xì)胞后，4℃下2 500×g離心5 min，以 PBS 再懸浮，隨后加入 250 μmol·L-1NADPH孵育，在λ=340 nm下觀察5 min，通過吸光率的減少來探測(cè)NADPH的消耗量。為分析NADPH氧化酶特異的活性，在檢測(cè)之前30 min加入10 μmol·L-1DPI，來檢測(cè)DPI抑制后的NADPH消耗率(the rate of consumption of NADPH inhibited by DPI)。用來計(jì)算NADPH消耗總量的吸收消光系數(shù)(absorption extinction coefficient)是 6.22mmol-1·cm-1，結(jié)果以pmol NADPH·min-1·mg-1蛋白表示。

1.2.6 免疫印跡法檢測(cè)JNK1/2磷酸化 取總蛋白30 μg加入上樣緩沖液煮沸3 min變性，經(jīng)十二烷基磺酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜，封閉后與稀釋一抗4℃孵育過夜，并與稀釋二抗室溫孵育1 h，再與化學(xué)發(fā)光試劑溫浴1 min后曝光、顯影和定影，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行吸光度掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 Pro對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞直徑增加的影響

刺激因素處理24 h后，相差顯微鏡測(cè)定心肌細(xì)胞直徑。結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞直徑為(22.29±23.78)μm;AngⅡ能顯著提高細(xì)胞直徑，各濃度Pro均使AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞直徑明顯減少，以上結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

2.2 Pro對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白合成速率上調(diào)的影響 結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞［3H］-亮氨酸摻入率為(2 175±285.6)cpm;AngⅡ作用24 h后，心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率較對(duì)照組明顯增加，各濃度Pro能減弱AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白合成速率的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2 Pro對(duì)蛋白質(zhì)合成速率的影響(n=6)A.對(duì)照組;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)組;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)組;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)組;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)組;與對(duì)照組比較，*1P＜0.01;與 Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)組比較，*2P＜0.05，*3P＜0.01Fig.2 Effects of propofol on protein synthesis rate(n=6)A.the control group;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)group;C.AngⅡ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)group;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)group;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)group;Compared with the control group，*1P＜0.01;Compared with the Ang Ⅱ group，*2P＜0.05，*3P＜0.01

2.3 Pro對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS水平增加的影響 結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞 ROS熒光強(qiáng)度為(16.22±1.89);AngⅡ作用24 h后，心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)ROS水平較對(duì)照組明顯增加。各濃度Pro處理后，ROS水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

2.4 Pro對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞NADPH氧化酶活性上調(diào)的影響 結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞NADPH氧化酶活性為(3.621±0.396)pmol·min-1·mg-1;Ang Ⅱ作用24 h后，心肌細(xì)胞Nox活性較對(duì)照組明顯增加。各濃度Pro處理后，Nox活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

2.5 Pro對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞JNK1/2磷酸化增強(qiáng)的影響 為證實(shí)Pro對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞JNK1/2磷酸化是否有抑制作用，免疫印跡法檢測(cè)各組p-JNK1/2蛋白表達(dá)，結(jié)果示:對(duì)照組p-JNK1/2蛋白表達(dá)(相對(duì)吸光度)為(0.45±0.09);AngⅡ作用 24 h后，心肌細(xì)胞總-JNK1/2(t-JNK1/2)無顯著改變，而p-JNK1/2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，而各濃度Pro處理后能顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的JNK1/2磷酸化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或 P＜0.01)。見圖5。

圖3 Pro對(duì)ROS水平的影響(n=6)A.對(duì)照組;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)組;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol ·L-1)組;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol ·L-1)組;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)組;與對(duì)照組比較，*1P＜0.01;與 Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)組比較，*2P＜0.05，*3P＜0.01Fig.3 Effects of propofol on ROS level(n=6)A.the control group;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)group;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)group;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)group;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)group;Compared with the control group，*1P＜0.01;Compared with the Ang Ⅱ group，*2P＜0.05，*3P＜0.01

圖4 Pro對(duì)Nox活性的影響(n=6)A.對(duì)照組;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)組;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol ·L-1)組;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol ·L-1)組;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)組;與對(duì)照組比較，*1P＜0.01;與 Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)組比較，*2P＜0.05，*3P＜0.01Fig.4 Effects of propofol on NOX activity(n=6)A.the control group;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)group;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)group;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)group;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)group;Compared with the control group，*1P＜0.01;Compared with the Ang Ⅱ group，*2P＜0.05，*3P＜0.01

3 討論

心肌細(xì)胞肥大是心肌細(xì)胞對(duì)高血壓、心肌梗死及先天性心臟病等常見臨床疾病的一種應(yīng)答反應(yīng)。長期應(yīng)激所致持續(xù)性心肌肥大可增加心力衰竭和猝死風(fēng)險(xiǎn)。因此尋找有效的逆轉(zhuǎn)心肌肥大的途徑是目前醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)。

圖5 Pro對(duì)JNK1/2磷酸化的影響(n=6)A.對(duì)照組;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)組;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)組;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)組;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)組;與對(duì)照組比較，*1P＜0.01;與 Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)組比較，*2P＜0.05，*3P＜0.01Fig.5 Effects of propofol on the phosphorylation of JNK1/2(n=6)A.the control group;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)group;C.AngⅡ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)group;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)group;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)group;Compared with the control group，*1P＜0.01;Compared with the Ang Ⅱ group，*2P＜0.05，*3P＜0.01

近年來，丙泊酚被廣泛應(yīng)用于臨床，其抗氧化活性逐漸受到人們的重視。丙泊酚結(jié)構(gòu)類似于內(nèi)源性抗氧化劑維生素E與外源性抗氧化劑丁羥基甲苯，能有效地防治各種氧化應(yīng)激損傷，機(jī)制包括清除自由基、抑制過氧化反應(yīng)、抑制大鼠心肌線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔道開放等方面［5］。本研究結(jié)果證實(shí)，丙泊酚能顯著抑制AngⅡ所上調(diào)的心肌肥大相關(guān)指標(biāo)，如細(xì)胞直徑、蛋白合成速率等，誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大，體外實(shí)驗(yàn)說明其參與了心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程，但機(jī)制仍有待探討。

過氧化氫、超氧陰離子及羥基統(tǒng)稱為活性氧，能夠激活A(yù)ngⅡ下游的關(guān)鍵信號(hào)通路，介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大［10］。NADPH氧化酶是胞內(nèi)ROS的主要來源。本研究提示丙泊酚能顯著抑制AngⅡ所上調(diào)的Nox活性及ROS水平，并能抑制ROS下游的JNK1/2磷酸化。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床研究中也發(fā)現(xiàn)丙泊酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力［11-12］。

本研究提示，丙泊酚能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，機(jī)制與抑制Nox活性、減少ROS水平并抑制JNK1/2磷酸化有關(guān)。但其對(duì)其他因素(如內(nèi)皮素、去甲腎上腺素等)誘導(dǎo)的心肌肥大有無作用，尚待進(jìn)一步研究。

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