差示光度法測定高含量茶氨酸

高小紅，章小林

(1.武漢理工大學(xué)華夏學(xué)院化學(xué)與制藥工程系，湖北 武漢 430223；2.華爍科技股份有限公司，湖北 武漢 430074)

茶氨酸是茶葉中特有的一種氨基酸，其含量直接影響到茶葉的品質(zhì)[1]。自1950年日本學(xué)者首次分離出茶氨酸以來，已經(jīng)出現(xiàn)了多種分析方法[2]，但由于茶氨酸制品成分比較復(fù)雜，特別是含有許多與茶氨酸性質(zhì)極其相似的氨基酸，導(dǎo)致堿式碳酸銅沉淀法和高氯酸非水滴定法具有明顯的誤差；普通吸光光度法和儀器分析法由于相對誤差較大或者需要價格高昂的標(biāo)準(zhǔn)對照品，也不適用于日常高含量茶氨酸制品的分析。目前，國內(nèi)外多采用日本藥局(JP2000)標(biāo)準(zhǔn)，通過測定比旋光度和熔點來確定制品的純度。

作者在前期工作[3]的基礎(chǔ)上，采用差示光度法測定高含量的茶氨酸，取得了滿意的結(jié)果。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，碳酸氫鈉，鹽酸，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，次氯酸鈉，碘化鉀，可溶性淀粉，均為分析純。

721型分光光度計，上海第三分析儀器廠。

1.2 溶液配制

碳酸氫鈉溶液：稱取碳酸氫鈉60.0 g，溶于約500 mL蒸餾水中，定容至1000 mL。

茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取105 ℃烘至恒重(約2 h)的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.4000 g，加6.0 mol·L-1鹽酸10 mL，在80 ℃加熱回流5 h，然后加1.0 mol·L-1NaOH溶液60 mL，定容至1000 mL，得400 μg·mL-1茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL稀釋至100 mL，即得20 μg·mL-1茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

亞硝酸鈉溶液：稱取亞硝酸鈉5.0 g，溶于約50 mL蒸餾水中，定容至100 mL。

次氯酸鈉溶液：取市售次氯酸鈉試劑，用碘量法標(biāo)定有效氯含量(不低于5.2%)后，用去離子水稀釋至有效氯含量為5 g·L-1。

顯色液：稱取1.0 g可溶性淀粉，用2 mL蒸餾水調(diào)勻，加入100 mL沸騰的蒸餾水，邊搖邊加熱，煮沸2 min，冷卻后以定量濾紙濾去不溶物，加入1.0 g氫氧化鈉，搖至全部溶解后，加入1.0 g碘化鉀。

1.3 方法

取2個50 mL容量瓶，1#瓶加入400 μg·mL-1的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL、20 μg·mL-1的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL和碳酸氫鈉溶液20 mL，2#瓶加入400 μg·mL-1的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL 和碳酸氫鈉溶液20 mL，混勻；分別加入3 mL次氯酸鈉溶液，放置1 min；加入亞硝酸鈉溶液5 mL，混勻，放置5 min；加入2 mL顯色液，用碳酸氫鈉溶液定容至刻度，充分搖勻后，立即(2～10 min內(nèi))以蒸餾水為參比用3 cm比色皿在分光光度計上于570 nm波長處分別測定其吸光度值A(chǔ)1和A2，計算△A=A1-A2。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜

配制一定濃度的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3方法操作，用分光光度計在490～690 nm范圍內(nèi)測其吸光度△A，結(jié)果見圖1。

圖1 吸收光譜

由圖1可見，最大吸收波長為570 nm。因此，后續(xù)實驗選擇570 nm為測定波長。

2.2 條件實驗

2.2.1 次氯酸鈉溶液加入量的選擇

按1.3方法，固定其它試劑加入量不變，改變次氯酸鈉溶液加入量為1～5 mL，測其吸光度。結(jié)果表明，次氯酸鈉溶液加入量選擇3 mL較為適宜。

2.2.2 亞硝酸鈉溶液加入量的選擇

按1.3方法，固定其它試劑加入量不變，改變亞硝酸鈉溶液加入量為3～7 mL，測其吸光度。結(jié)果表明，亞硝酸鈉溶液加入量選擇5 mL較為適宜。

2.2.3 顯色液加入量的選擇

按1.3方法，固定其它試劑加入量不變，改變顯色液加入量為1～3 mL，測其吸光度。結(jié)果表明，顯色液加入量選擇2 mL較為適宜。

2.2.4 碳酸氫鈉溶液加入量的選擇

按1.3方法，固定其它試劑加入量不變，改變碳酸氫鈉溶液加入量為20～39 mL，測其吸光度。結(jié)果表明，碳酸氫鈉溶液加入量≥28 mL時，吸光度△A保持不變。這是因為碳酸氫鈉是一種緩沖溶液。為保持本實驗體系pH值恒定，本實驗用碳酸氫鈉溶液將溶液定容至50 mL。

2.2.5 顯色穩(wěn)定時間的確定

胺的氯代衍生物能氧化碘化鉀而析出碘，在加入淀粉后，溶液的顏色即可達到最深，10 min內(nèi)吸光度穩(wěn)定。因此，須在10 min內(nèi)完成測定。

2.3 工作曲線及檢出限

取6個50 mL容量瓶，各加入400 μg·mL-1茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，再分別加入20 μg·mL-1茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL，在上述選定的實驗條件下，以400 μg·(50 mL)-1(8.0 mg·L-1)茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比，測定△A。結(jié)果表明，茶氨酸濃度在8.0～10.0 mg·L-1范圍內(nèi)，△C(△C為各容量瓶中所含茶氨酸的微克數(shù)與參比溶液的差值)與吸光度△A呈線性關(guān)系，線性回歸方程為：△A=0.0061△C，R=0.9998。

2.4 干擾實驗

實驗測定460 μg·(50 mL)-1茶氨酸時，1 mg·(50 mL)-1的谷氨酸、絲氨酸、丙氨酸均不干擾測定。

2.5 精密度實驗

按1.3方法測定9.2 mg·L-1茶氨酸溶液，平行11次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤0.3%，符合分析高含量物質(zhì)的精度要求。

2.6 樣品分析

準(zhǔn)確稱取茶氨酸樣品0.3000 g，加6.0 mol·L-1鹽酸10 mL，在80 ℃加熱回流5 h，然后加入1.0 mol·L-1NaOH溶液60 mL，定容至1000 mL，分取適量的樣品溶液(控制茶氨酸濃度在8.0～10.0 mg·L-1范圍內(nèi))，按1.3方法進行分析測定并進行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表1。

表1 樣品中茶氨酸測定結(jié)果

3 結(jié)論

以8.0 mg·L-1茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比，在570 nm波長處進行差示光度測定。結(jié)果表明，茶氨酸濃度在8.0～10.0 mg·L-1范圍內(nèi)△C與△A呈線性關(guān)系；9.2 mg·L-1茶氨酸溶液相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤0.3%。該法操作簡單、費用低、準(zhǔn)確度高，結(jié)果令人滿意，用于高含量茶氨酸的測定，可排除其它氨基酸的干擾。

[1] 王澤農(nóng).茶葉生物化學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1980：48-56.

[2] 高小紅，袁華.茶氨酸的分析測試研究[J].氨基酸和生物資源，2004，26(2)：74-76.

[3] 高小紅，章小林，袁華.分光光度法測定茶葉中的茶氨酸[J].光譜實驗室，2005，22(3)：524-526.