香附不同炮制品HPLC指紋圖譜研究

徐 媛 ，張文娟 ，王慶偉 ，劉新友 ，程 敏

1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710038；2.陜西商洛學(xué)院生物醫(yī)藥工程系，陜西 商洛 726000

香附來源于莎草科植物莎草（Cyperus Rotundus L.）的干燥根莖，性辛，味微苦、微甘，性平，歸肝、脾、三焦經(jīng)，是臨床常用中藥，具有疏肝理氣、調(diào)經(jīng)止痛之功效[1]。其炮制方法多樣，用途極其廣泛。筆者采用指紋圖譜研究的方法，對(duì)香附及經(jīng)不同方法（醋炙、酒炙、炒炭）炮制后的香附炮制品的化學(xué)成分變化作了初步研究，發(fā)現(xiàn)香附經(jīng)不同方法炮制后，化學(xué)成分存在很大差異。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津SPD-10AvP）；超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器廠）；電子分析天平（BS 223S賽多利斯）；粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司，型號(hào)：FW200）；電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：98-1-B）。

甲醇（天津市紅巖化學(xué)試劑廠，分析純）；流動(dòng)相所用甲醇為色譜純（美國(guó)FISHER公司）；水為純化水；α-香附酮對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110748-201010，含量測(cè)定用）；香附藥材（購(gòu)于西安中藥飲片廠，產(chǎn)地陜西產(chǎn)關(guān)中，經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室王四旺教授鑒定為莎草科植物莎草的根莖，批號(hào)：20100501）。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS-2（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（0～5 min，甲醇比例為 10%～50%；6～50 min，甲醇比例為51%～100%），二元梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；記錄時(shí)間：60 min。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取α-香附酮對(duì)照品適量，用甲醇制成0.02 mg/ml的溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

取待測(cè)樣品30 g，加甲醇80 ml，超聲提取30 min，放至室溫后甲醇定容至100 ml，搖勻，靜置后濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.3 檢測(cè)法

分別吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μl注入高效液相色譜儀。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、6、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定色譜圖，對(duì)主要峰峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定色譜圖保留時(shí)間穩(wěn)定，主要峰峰面積相對(duì)RSD為1.25%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜圖，對(duì)主要峰峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果6次測(cè)定色譜圖保留時(shí)間穩(wěn)定，主要峰峰面積相對(duì)RSD為0.72%，精密度良好，符合規(guī)定。

2.1.4.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批次香附藥材 （生香附），按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜圖，對(duì)主要峰峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果6次測(cè)定色譜圖保留時(shí)間穩(wěn)定，主要峰峰面積相對(duì)RSD為0.72%，重現(xiàn)性良好，符合規(guī)定。

2.2 指紋圖譜測(cè)定

2.2.1 香附不同炮制品的制備

根據(jù)《中藥炮制學(xué)》[2]對(duì)香附進(jìn)行不同方法的炮制。

2.2.1.1 生香附 取原藥材100 g，除去毛須及雜質(zhì)，碾成綠豆大顆粒，浸透或切薄片，干燥，篩去碎屑備用。

2.2.1.2 醋香附（醋炒）取凈香附飲片100 g，加20 g米醋拌勻，悶潤(rùn)至醋被吸盡，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱炒干，取出晾涼備用。

2.2.1.3 酒香附 取凈香附飲片100 g，加入20 g黃酒拌勻，悶潤(rùn)至黃酒被吸盡，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱炒干，取出晾涼，篩去碎屑備用。

2.2.1.4 香附炭 取凈香附飲片100 g，置炒制容器內(nèi)，用中火加熱，炒至表面焦黑色，內(nèi)部焦褐色，噴淋清水少許，滅盡火星，取出晾干，涼透，篩去碎屑備用。

2.2.2 香附及不同炮制品指紋圖譜研究

分別取香附及不同炮制品依照“2.1.2”制備供試品，于上述色譜條件下進(jìn)樣記錄指紋圖譜。

2.3 結(jié)果

2.3.1 對(duì)照品、生香附及炮制品提取液色譜圖

對(duì)照品、生香附及炮制品提取液色譜圖，見圖1。

圖1 香附指紋圖譜

2.3.2 不同炮制品甲醇提取物主要色譜峰保留時(shí)間及峰面積

不同炮制品甲醇提取物主要色譜峰保留時(shí)間及峰面積，見表1。

結(jié)果顯示，16號(hào)峰為α-香附酮的色譜峰，作為基準(zhǔn)峰。1號(hào)峰的峰面積變化明顯，醋香附＞酒香附、香附炭＞生香附，各炮制品峰面積均遠(yuǎn)大于生香附，而醋香附的峰面積明顯大于其他炮制品；2號(hào)峰的峰面積，香附炭＞酒香附＞醋香附＞生香附，各炮制品峰面積差異均顯著；3號(hào)峰的峰面積，香附炭＞醋香附＞酒香附＞生香附，香附炭峰面積遠(yuǎn)大于其他各炮制品；4、5、8、9、10、13、14、16、17 號(hào)峰中香附炭遠(yuǎn)小于其他炮制品，生香附、醋香附、酒香附的峰面積變化不大；6號(hào)峰生香附、醋香附、酒香附變化不大，香附炭在該保留時(shí)間無峰；7號(hào)峰的峰面積，生香附＞酒香附＞香附炭＞醋香附，醋香附、香附炭峰面積顯著小于生香附、酒香附，生香附、酒香附變化不大；18號(hào)峰的峰面積，生香附＞醋香附＞酒香附＞香附炭，各炮制品峰面積變化明顯；19號(hào)峰僅生香附、香附炭有峰，且生香附峰面積，遠(yuǎn)大于香附炭，而酒香附、醋香附均無峰；20、21號(hào)峰的峰面積，酒香附＞醋香附＞生香附＞香附炭，生香附、醋香附峰面積差異不大，而酒香附遠(yuǎn)大于其他炮制品，香附炭峰面積遠(yuǎn)小于其他炮制品；11、12、15號(hào)峰無明顯差異。

3 討論

實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)不同流動(dòng)相及柱溫進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，柱溫在30℃時(shí)，以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫能使樣品中各成分的色譜峰較好分離，60 min后無色譜峰出現(xiàn)。

表1 香附炮制品甲醇提取物主要峰的保留時(shí)間及峰面積

對(duì)香附不同炮制品指紋圖譜進(jìn)行比較，結(jié)果顯示不同炮制品之間成分差異顯著，主要表現(xiàn)在30 min后主要峰的減少與30 min前主要峰的增加，即脂溶性成分的減少與水溶性成分的增加，與傳統(tǒng)中藥炮制理論相一致。

中藥成分復(fù)雜，將指紋圖譜研究應(yīng)用于中藥炮制的研究與單一成分研究相比，更能真實(shí)地反映炮制對(duì)中藥成分的影響，如能結(jié)合成分結(jié)構(gòu)鑒定，將能得到更詳盡的數(shù)據(jù)，對(duì)炮制引起的中藥成分變化做出更深入的描述。

歷代本草及中醫(yī)藥專著中記載香附的炮制品種繁多，唐代有炒制法；宋代有蒸制、煮制、酒制、米泔浸后蒜仁制、石灰制、膽汁制、童便粗鹽水制、炭制等；元代有醋煮制、童便制、麩炒制；到了明、清時(shí)代，除沿用元代以前的炮制方法外，最突出的是在輔料制方面增加較多，如有酒、醋、姜、童便的“四制香附”、“五制香附”、“六制香附”、“七制香附”等炮制方法[2]?！侗窘?jīng)逢原》[3]記載：“入血分補(bǔ)虛童便浸炒；調(diào)氣鹽水浸炒；行經(jīng)絡(luò)酒浸炒；消積聚醋浸炒；氣血不調(diào)，胸膈不利，則四者兼制；肥盛多痰，姜汁浸炒；止崩漏血，童便制炒黑；走表藥中則生用之”。《本草綱目》[4]也對(duì)其有“生則上行胸膈，外達(dá)皮膚；熟則下走肝腎，外徹腰足。炒黑則止血，得童溲浸炒則入血分而補(bǔ)虛，鹽水浸炒則入血分而潤(rùn)燥……酒浸炒則行經(jīng)絡(luò)，醋浸炒則消積聚，姜汁炒則化痰飲?！钡挠涊d，被譽(yù)為“血中之氣藥”、“氣病之總司，女科之主帥”。本文主要對(duì)現(xiàn)代臨床常用的生香附、醋香附、酒香附和香附炭4種炮制品的指紋圖譜進(jìn)行了分析。

香附主要含有揮發(fā)油類成分，其所含揮發(fā)油類成分為0.65%～1.40%，迄今已從其揮發(fā)油中分離出了140多種成分，包括單萜、倍半萜及其氧化物，多數(shù)已確定其結(jié)構(gòu)式，主要為α-香附酮、α-香附烯 （含量之和約占揮發(fā)油的28.85%）[5-7]。此外，香附還有糖類、生物堿類、苷類、黃酮類、酚類和三萜類化合物[8-9]，但相關(guān)結(jié)構(gòu)鑒定報(bào)道尚少。本文采用指紋圖譜對(duì)香附不同炮制品進(jìn)行初步分析，為具體成分的分離鑒定奠定了基礎(chǔ)。

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