兩種校準(zhǔn)品和3種雙縮脲試劑測定血清總蛋白結(jié)果偏倚評估及方法學(xué)評價

王時南 楊 歡

雙縮脲法測定血清總蛋白至今已將近100年的歷史，其間不少學(xué)者對其進行了系統(tǒng)的實驗并發(fā)表了大量的文獻。美國臨床化學(xué)協(xié)會和國際臨床化學(xué)協(xié)會以Doumas1975年提出的配方為推薦方法［1］;1981年Doumas又將該法推薦為侯選參考方法;《全國臨床檢驗操作規(guī)程》推薦Doumas雙縮脲配方做為血清總蛋白測定常規(guī)方法［2］。鑒于當(dāng)時國內(nèi)雙縮脲試劑配方很不一致，國內(nèi)有學(xué)者對不同配方的雙縮脲試劑進行了標(biāo)準(zhǔn)化評價，并提出有必要對其配方進行統(tǒng)一［3］。但目前國內(nèi)不同廠家生產(chǎn)的雙縮脲試劑盒其配方仍存在著較大的差異，而且不同實驗室應(yīng)用的校準(zhǔn)品也不一致。已有報道，一些項目的試劑或校準(zhǔn)品不同，其結(jié)果存在有明顯的差異［4，5］。為此，我們對兩種校準(zhǔn)品和3種雙縮脲試劑盒測定血清總蛋白結(jié)果進行了實驗。

材料與方法

1.試劑與儀器:(1)羅氏公司(Roche)生產(chǎn)校準(zhǔn)血清(c.f.a.s):總蛋白濃度標(biāo)示值為50.2g/L(其中清蛋白為35.0g/L)?？偟鞍讟?biāo)準(zhǔn)液(其成分為純清蛋白)，濃度標(biāo)示值為50.0g/L，由上?？迫A東菱診斷用品有限公司產(chǎn)品提供;②3種雙縮脲試劑盒配方見表1;③儀器AU5400全自動生化分析儀。

2.實驗樣本:筆者醫(yī)院門診及住院病人新鮮血清標(biāo)本。

3.方法:①試劑盒 A、B、C 分別與校準(zhǔn)血清(c.f.a.s)和總蛋白標(biāo)準(zhǔn)液組合成6個檢測系統(tǒng)，其中以試劑盒A(Doumas配方)與校準(zhǔn)血清(c.f.a.s)和總蛋白標(biāo)準(zhǔn)液分別組成為兩個參照系統(tǒng)，試劑盒B和C與校準(zhǔn)血清(c.f.a.s)和總蛋白標(biāo)準(zhǔn)液分別組成各兩個待檢系統(tǒng);②按NCCLS EP9－A文件，每日選取高、中、低值新鮮臨床血清標(biāo)本10份，分別用3種試劑按順序1→10進行測定，再按相反順序10→1重復(fù)測定，共測定5天，記錄結(jié)果，去除離群點，計算線性方程、相關(guān)系數(shù)、偏倚評估與統(tǒng)計學(xué)分析;③收集肝功檢測剩余無脂濁、無黃膽、無溶血血清制成高值(85.5g/L)和低值(55.2g/L)兩份血清(其濃度經(jīng)試劑A和校準(zhǔn)血清測得)，然后將高、低值2份血清每天上午、下午各測定1次，每次測雙份，共測20天，按NCCLS EP5－A文件，計算它們批內(nèi)、批間、日間和總CV%;④用血清總蛋白含量為120g/L和 40g/L兩份標(biāo)本按不同4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4 比例混合，其血清總蛋白濃度依次為 120g/L、100g/L、80g/L、60g/L、40g/L 5 份標(biāo)本，每份標(biāo)本用 3 種雙縮脲試劑盒各測定4次，然后按NCCLS EP6－P文件方案評價線性［8］;⑤1份血清總蛋白濃度為71.3g/L，用3種雙縮脲試劑測定，比較它們的反應(yīng)曲線;⑥分析參數(shù):終點法，S 3.0μl，R150μl，主/副波長540nm/660nm，讀數(shù)點0～27，反應(yīng)方向正向;⑦離群點的檢查:計算樣本重復(fù)測定值間差值(Dxi和Dyi)的平均數(shù)和兩種檢測系統(tǒng)測定結(jié)果均值差(Yi－Xi)的平均數(shù);超出上述平均數(shù)4倍時，檢驗結(jié)果視為離群點，應(yīng)棄去，必要時重做;⑧相關(guān)系數(shù)r≥0.975(或 r2≥0.95)說明兩試劑測定結(jié)果相關(guān)良好，當(dāng)r＜0.975，可通過測定另外標(biāo)本來擴寬X范圍。

5.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 16.0和Excel 2003軟件;顯著性檢驗均采用配對t檢驗。

結(jié) 果

1.實驗數(shù)據(jù)經(jīng)計算判斷均無離群點，r2均 ＞0.95。3種雙縮脲試劑盒、兩種校準(zhǔn)品測定血清總蛋白結(jié)果見表2。

2.用羅氏公司生產(chǎn)校準(zhǔn)血清(c.f.a.s)校準(zhǔn)，以試劑盒A為參照系統(tǒng)，試劑盒B和試劑盒C為待檢系統(tǒng)，其散點圖見圖1、圖2，偏倚圖見圖3、圖4。

圖1 試劑盒A與試劑盒B散點圖n=50，r=0.9989，y=1.01x －1.08

3.用總蛋白標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)，以試劑盒A為參照系統(tǒng)，試劑盒B和試劑盒C為待檢系統(tǒng)，散點圖見圖5、圖6，偏倚圖見圖7、圖8。

圖2 試劑盒A與試劑盒C測定結(jié)果散點圖n=50，r=0.9995，y=1.00x+0.03

4.根據(jù)圖1、圖2中的回歸方程Roche校準(zhǔn)品雙縮脲試劑盒A與試劑盒B、C預(yù)期偏倚估計:見表3。

5.根據(jù)圖4、圖6中的回歸方程總蛋白標(biāo)準(zhǔn)液雙縮脲試劑盒A與試劑盒B、C預(yù)期偏倚估計:見表4。

表3 Roche校準(zhǔn)品雙縮脲試劑盒A與試劑盒B、C預(yù)期偏倚估計

表4 總蛋白標(biāo)準(zhǔn)液雙縮脲試劑盒A與試劑盒B、C預(yù)期偏倚估計

6.3種雙縮脲試劑測定血清總蛋白高、低值標(biāo)本 批內(nèi)、批間、日間和總CV%:見表5。

表5 3種雙縮脲試劑盒測定血清總蛋白批內(nèi)、批間、日間和總CV%

7.3種雙縮脲試劑盒測定血清總蛋白(濃度為71.3g/L)反應(yīng)曲線的比較:見圖9。

8.3種雙縮脲試劑盒測定血清總蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線:見圖10。

按NCCLS EP6－P文件線性評價方案，經(jīng)統(tǒng)計處理，3種雙縮脲試劑盒稀釋變異均可接受(C＜C0.05)，試劑盒 A和試劑盒 B線性良好(F＜F0.05)，試劑盒C不可接受(F＞F0.05)。

討 論

目前市場上雙縮脲試劑盒配方的成分大致上相同，但在各成分的質(zhì)量上仍存在有一定的差異，而測定血清總蛋白的參考物一般為基質(zhì)狀態(tài)與病人血清標(biāo)本基本相似的校準(zhǔn)血清或系純清蛋白配制而成的總蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。雙縮脲法測定血清總蛋白結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于血清蛋白主要組分參考物的有效性和測定血清不同組分在雙縮脲反應(yīng)中呈色的一致性。Doumas于1981年驗證了他推薦的雙縮脲試劑配方對γ球蛋白(其成分99.1%為IgG)和人清蛋白二者的吸光度是一致的。如果用基質(zhì)狀態(tài)與病人血清標(biāo)本基本相似的校準(zhǔn)血清校準(zhǔn)，試劑配方對測定結(jié)果可能無明顯影響，如用純清蛋白配制而成的總蛋白標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)，因與病人血清標(biāo)本基質(zhì)狀態(tài)存在有明顯的差異，不同雙縮脲試劑配方測定結(jié)果就有可能產(chǎn)生偏倚，其偏倚的大小與方向取決于測定血清標(biāo)本中清、球蛋白量及與該雙縮脲試劑反應(yīng)中呈色的差異。因此，用Doumas配方的雙縮脲試劑，兩種校準(zhǔn)品測定結(jié)果的偏倚，主要是兩種校準(zhǔn)品校準(zhǔn)值存在差異。

本實驗結(jié)果表明，用羅氏公司生產(chǎn)校準(zhǔn)血清(c.f.a.s)校準(zhǔn)儀器時，3種雙縮脲試劑盒測定50份臨床血清標(biāo)本結(jié)果均值相對偏倚小于0.76%，試劑盒B、C與試劑盒A比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。如用總蛋白標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)儀器，試劑盒B與試劑盒A比較，50份臨床血清標(biāo)本結(jié)果均值相對偏倚為0.1%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而試劑盒C與試劑盒A比較，50份臨床血清標(biāo)本結(jié)果均值相對偏倚為2.19%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明兩試劑測定結(jié)果存在有明顯的系統(tǒng)誤差。同一試劑用兩種校準(zhǔn)品測定50份臨床血清標(biāo)本，3種雙縮脲試劑盒均值相對偏倚為1.0% ～3.5%，經(jīng)統(tǒng)計分析，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

從表2～表4中我們可以看出，無論用校準(zhǔn)血清(c.f.a.s)還是用總蛋白標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)儀器，雙縮脲試劑盒B和C與雙縮脲試劑盒A比較的相對偏倚為0% ～2.19%，預(yù)期相對偏倚為 －3.68% ～0.22%，均小于CLIA＇881/2總允許誤差。由表5中可知，3種雙縮脲試劑盒測定血清總蛋白總CV為0.86% ～1.16%，均遠(yuǎn)小于CLIA＇881/4總允許誤差。這也許是我國目前雙縮脲法測定血清總蛋白試劑配方得不到統(tǒng)一的主要原因。從圖9、圖10中可以看出，讀數(shù)點0～27，3種雙縮脲試劑盒反應(yīng)均已基本完全;波長為540nm時，試劑盒A的吸光度明顯高于試劑盒B和C;試劑盒A和試劑盒B線性優(yōu)于試劑盒C。

鑒于本實驗的結(jié)果，我們建議盡可能選用試劑盒A配方即Doumas配方。因客觀原因(如試劑不中標(biāo))不能選用試劑盒A配方時，應(yīng)選用與病人血清標(biāo)本基質(zhì)狀態(tài)相似的校準(zhǔn)品，以提高不同實驗室間血清總蛋白測定結(jié)果的可比性。

1 Doumas BT.Standards for total serum protein assays a collaborative study［J］.Clin Chem，1975，21:1159－1166

2 葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.3版，南京:東南大學(xué)出版社，2006:337－339

3 陸永綏，潘秋英，陳秀樞，等.血清總蛋白測定雙縮脲試劑及標(biāo)準(zhǔn)化評價［J］.臨床檢驗雜志，1996，14(3):115 －117

4 王時南，陳彬彬.兩種膽固醇試劑偏倚評估及可比性研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36(11):90 －91

5 王時南.膽固醇兩種校準(zhǔn)品測定結(jié)果偏倚評估及校準(zhǔn)品應(yīng)用中的問題［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20(3):602 －603