Ki－67與COX－2在結直腸癌中的表達及其在浸潤轉移中的意義

周伶俐 葉樂馳 鄭晨果 金 瑩 徐永強 陳 榮

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其浸潤轉移是患者死亡的主要原因，目前從分子水平研究結直腸癌是近年來的熱點。筆者采用免疫組化方法，檢測結直腸癌組織中COX－2和Ki－67蛋白表達水平，并結合臨床資料分析其與結直腸癌浸潤轉移的關系及兩者蛋白表達的相關性，為判斷結直腸癌的生物學行為和患者預后提供一定參考指標。

資料與方法

1.一般資料:取筆者醫(yī)院2008年3月～2010年3月期間資料完整的根治性結直腸腺癌手術切除標本104例為對象(表1)，進行免疫組化學染色，其中包括結腸癌36例和直腸癌48例，患者男性64例，女性40例，平均年齡58歲(40～76歲)。所有病例術前均未接受化療及放療。

表1 臨床病理參數與Ki－67、COX－2蛋白表達關系

2.主要試劑及儀器:醫(yī)用石蠟塊、切片機、烘片機、光學顯微鏡等由本院病理科提供。免疫組化染色(Elivision法)所用即用型兔抗人COX－2、Ki－67單克隆抗體及Elivision試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

3.免疫組化染色方法:所有組織標本均經10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS沖洗，對組織COX－2和Ki－67抗原分別用檸檬酸緩沖液高溫高壓修復和EDTA水浴熱修復;0.3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶，PBS沖洗;加一抗，室溫下孵育60min，PBS沖洗;加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20min，PBS沖洗;加酶標抗鼠/兔聚合物(試劑 B)，室溫下孵育30min，PBS沖洗;DAB染色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，脫水、透明、封片，鏡檢。以PBS代替一抗作陰性對照，以福州邁新生物技術開發(fā)有限公司提供的已知陽性結果的切片作為陽性對照。

4.陽性染色判定標準:免疫組化結果判定以出現棕黃色顆粒為陽性。COX－2抗原陽性產物定位于腫瘤細胞的細胞質或細胞膜。每張切片選擇5個以上高倍視野，計數不少于500個細胞進行陽性計數及評分。根據染色程度及染色細胞百分率進行評分:基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色適中者為2分，著色深者為3分;著色細胞占計數細胞的百分率＜5%為0分，5% ～25%為1分，25% ～50%為2分，＞50%為3分。將每張切片的染色程度與染色細胞百分率得分相乘，其乘積為最后得分:＜3分為陰性，≥3分為陽性。Ki－67抗原陽性產物定位于腫瘤細胞的細胞核內，細胞質一般不著色，部分細胞核分裂時顯示出整個細胞的陽性反應。Ki－67計數其陽性指數，取50個高倍視野腫瘤細胞陽性率的平均數，≥5%即為陽性。

5.統計學方法:統計學處理應用SPSS 17.0軟件完成，計數資料用例數進行描述，比較方法采用χ2檢驗或Fisher's Exact Test，相關分析方法采用Spear秩相關。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1.Ki－67和COX－2蛋白表達(表1):104例結直腸癌組織中Ki－67和COX－2陽性表達率分別為76.0%(79/104)和 84.6%(88/104)。Ki－ 67 和COX－2蛋白表達率與結直腸癌患者性別、年齡無關(P＞0.05)。Ki－67或 COX－2蛋白在結直腸癌有淋巴結轉移組或有遠處轉移組的表達率均分別高于無淋巴轉移組或無遠處轉移組(P＜0.05)，并且在結直腸癌浸潤黏膜層及肌層組的表達率也高于浸潤至全層及漿膜外組(P＜0.05)。COX－2蛋白表達率在腫瘤最大徑≥5cm組較腫瘤最大徑＜5cm組偏高(P＜0.05)，而Ki－67蛋白在腫瘤最大徑≥5cm組的表達率與腫瘤最大徑＜5cm組的表達率相比較，無統計學差別。隨著癌組織分化程度的增高，Ki－67表達率依次降低，但無統計學差異(P＞0.05)。

2.結直腸癌組織中Ki－67和COX－2蛋白表達的相互關系:在Ki－67陽性表達的79例腸癌組織中，COX－2陽性表達者69例;在Ki－67陰性表達的25例腸癌中，COX－2陰性表達者6例。結直腸癌Ki－67表達與COX－2表達之間未存在明顯相關性(表2)。

表2 Ki－67表達與COX－2表達之間的關系

討 論

近年，結直腸癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢。WHO資料表明，結直腸癌已成為西方各種惡性腫瘤中發(fā)病率最高的，并居惡性腫瘤死亡原因的第2位，在我國發(fā)病率已占到常見腫瘤的第4位，其發(fā)生侵襲轉移是患者死亡的主要原因［1，2］。已知結直腸癌的浸潤轉移是多步驟、多因素參與的復雜過程.多種相關基因的激活是導致腫瘤細胞發(fā)生浸潤轉移的重要因素，因此了解結直腸癌侵襲轉移機制將有助于提高我們對其的診斷和治療水平。

Ki－67即細胞增生相關核抗原，為Gerdes等［3］首先發(fā)現，其表達范圍覆蓋除G0期以外的各增殖周期細胞，是調節(jié)細胞周期必不可少的組成部分，故可作為評價細胞生長分數的指標。Ki－67在多種腫瘤及癌前病變中均有異常表達，通過對其抗原的檢測，可以相對反映腫瘤細胞的增殖狀態(tài)或增殖活性，因此，Ki－67被廣泛地用于做判斷腫瘤細胞增殖活性的指標［4，5］。目前有關腸癌細胞 Ki－67表達程度與結直腸癌預后的關系等方面的研究甚多，但存在諸多爭論，文獻報道也存在諸多分歧，其原因可能與統計方法、試劑、病例數、實驗方案、病例篩選條件、結果判斷標準等存在差異有關。

Terzi等［6］發(fā)現 Ki－67蛋白在結直腸癌患者的不同Dukes分期、血管浸潤、分化程度等組表達差異有統計學意義。另外研究發(fā)現［7］，Ki－67陽性表達與結直腸癌的生存率呈顯著負相關，陽性表達程度高者，術后生存期短，預后差。本研究發(fā)現，低分化腸癌Ki－67陽性表達率較高分化者高，但無統計學意義(P＞0.05)，說明尚不能通過檢測腸癌Ki－67表達程度來判斷腫瘤的惡性程度。淋巴結是否有轉移或遠處臟器是否有轉移是臨床評估病人預后的重要指標，本研究發(fā)現淋巴結有轉移者較淋巴結無轉移者以及有遠處轉移者較無遠處轉移者的Ki－67陽性表達率均存在統計學差異，表明增殖活性高的腸癌更易向周圍淋巴結及遠處臟器轉移。

COX－2是催化花生四烯酸轉化為前列腺素的關鍵酶，至少有 COX－1、COX－2兩個亞型，其中COX－2是－種誘導酶，靜息時不表達，由細胞因子、有絲分裂原和癌基因等刺激產生。COX－2在正常組織中一般無表達，但在某些消化道腫瘤中表達增加，如食管癌、胃癌。大量實驗表明COX－2可能在結直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起到一定作用，但與結直腸癌腫瘤生物學行為間相關性的研究尚未達成一致觀點［8］。Bouzourene等［9］報道結直腸癌 COX －2表達水平與腫瘤大小密切相關，其中腫瘤直徑＞3cm者COX－2表達水平顯著高于直徑＜3cm的病變，且認為COX－2陽性表達程度與結直腸癌的局部復發(fā)存在一定關聯，但與患者生存率未存在顯著相關性。

我們的研究結果顯示，COX－2在大多數結直腸癌中表達，提示COX－2不同程度地參與大部分腸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究表明較大癌灶(＞5cm)結直腸癌組織內COX－2表達水平顯著高于較小腫瘤(＜5cm)的表(P＜0.05)，這提示較大結直腸癌灶可產生較多量的COX－2維持結直腸癌的生長。另外發(fā)現伴有淋巴結轉移結直腸癌COX－2表達率(97.0%)顯著高于無淋巴結轉移病例(63.2%，P＜0.05)，浸潤深度達腸壁全層或漿膜外的結直腸癌COX－2表達率(95.9%)亦高于浸潤至肌層以內的病例(58.1%，P＜0.05)，與文獻報道相似。我們分析其原因，認為COX－2一方面可能產生丙二醇而導致致癌基因的活化和p53等抑癌基因的失活，另一方面COX－2可抑制凋亡發(fā)生，促進細胞黏附以及在使腫瘤浸潤轉移能力增強的同時使機體免疫下降?？梢奀OX－2過度表達對結直腸癌的發(fā)展、轉移有促進作用，抑制COX－2活性及表達對COX－2高表達結腸癌的防治具有積極意義。

惡性腫瘤的浸潤和轉移的發(fā)生是一個多因素作用的結果。COX－2與Ki－67在結直腸癌中表達的相關性研究至今未見正式報道。本研究發(fā)現，他們在淋巴結轉移、癌浸潤深度及遠處轉移之間的差別顯著，但兩者間表達未具有明顯相關性(P＞0.05)，一定程度上表明在腸癌臨床進展、浸潤轉移的生物學過程中，COX－2和Ki－67可能各自起著重要促進作用。

總之，本實驗結果表明Ki－67、COX－2與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關，特別是與其浸潤轉移的關系更為密切，提示檢測此兩者表達程度一定程度上可做為結直腸癌預后參考指標及指導制定臨床治療方案，可為揭示結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移機制提供了新線索。

1 孫燕，沈琳，葉穎江.大腸癌靶向治療進入個體化時代［J］.醫(yī)學研究雜志，2009，38(6):1 －2

2 Walsh JM，Salazar R，Nguyen TT，et al.Healthy colon，healthy life:a novel colorectal cancer screening intervention［J］.Am J Prev Med，2010，39(1):11 －14

3 Gerdes J，Schwab U，Lemke H，et al.Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation［J］.Int J Cancer，1983，31(1):13 －20

4 Hardiman G.Development of a bioassay to monitor circulating plasma Ki－67［J］.Leuk Res，2010，34(7):848 －849

5 Radovanovic－ Dinic B，Nagorni A，Katic V，et al.An immunohistochemical study of Ki－ 67 in colorectal adenoma［J］.Med Arh，2009，63(1):16－18

6 Terzi C，Canda AE，Sagol O，et al.Survivin，p53，and Ki－ 67 as predictors of histopathologic response in locally advanced rectal cancer treated with preoperative chemoradiotherapy［J］.Int J Colorectal Dis，2008，23(1):37 －45

7 Salminen E，Palmu S，Vahlberg T，et al.Increased proliferation activity measured by immunoreactive Ki－67 is associated with survival improvement in rectal/recto sigmoid cancer［J］.World J Gastroenterol，2005，11(21):3245 －3249

8 Wang D，Dubois RN.The role of COX－2 in intestinal inflammation and colorectal cancer［J］.Oncogene，2010，29(6):781 －788

9 Bouzourene H，Yan P，Sandmeier D，et al.The role of COX －2 in rectal cancer treated with preoperative radiotherapy［J］.Virchows Arch，2008，452(5):499 －505