延胡索藥材HPLC指紋圖譜研究

程 林 浦錦寶 鄭軍獻 梁衛(wèi)青 胡軼娟 魏克民

延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索(corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥塊莖，具有活血、利氣、止痛的功效，用于治療胸肋、脘腹疼痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，產(chǎn)后瘀阻，跌打腫痛等癥［1，2］。延胡索含多種生物堿，其中以延胡索甲、乙、丙素(原阿片堿)等為其主要成分［3］。延胡索為著名的浙八味之一，主產(chǎn)浙江省東陽、磐安一帶，本文參考相關文獻［4～11］對延胡索藥材的指紋圖譜進行了研究。

材料與方法

1.實驗材料:Varian高效液相色譜系統(tǒng)(Prostar 230，330，410)，BP 211D電子天平(德國 Sartorius公司)，色譜純甲醇(Merck)，高純水，其余試劑為分析純。延胡索乙素購于中國藥品生物制品檢定所(批號為110726－201011)。13批藥材作為供試品1～13號，其來源依次為:浙江磐安新渥鎮(zhèn)新渥村下塢、浙江磐安新渥鎮(zhèn)新渥村方崗嶺、浙江仙居田市、浙江磐安安文鎮(zhèn)胡村下百稱、浙江磐安深澤鄉(xiāng)上嶺頭、浙江磐安安文鎮(zhèn)王隱坑村、浙江磐安安文鎮(zhèn)胡村上門、浙江磐安安文鎮(zhèn)王隱坑村、陜西佛平縣、陜西漢中城固縣、陜西漢中城固縣、陜西漢中城固縣、浙江磐安深澤鄉(xiāng)上亨塘村。

2.實驗方法:(1)標準品溶液制備:延胡索乙素對照品溶液0.300mg/ml，與4℃冰箱保存。(2)供試品溶液制備:取延胡索生品粉末約0.5g，精密稱定，置平底燒瓶中，精密加入濃氨∶甲醇(1∶20)30ml，稱定重量，冷浸 1h 后，加熱回流 1h，放冷稱重，用濃氨∶甲醇(1∶20)補足重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液20ml，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45μmol/L)過濾即得。(3)層析條件:層析柱:Thermo hypersil GOLD C18(250mm ×4.6mm，粒徑5.0μm);流動相:A 相(甲醇)，B 相(0.1% 磷酸水pH5.0);梯度洗脫程序見表1。進樣體積15μl，柱溫30℃，檢測波長280nm。(4)方法學考察:①對照試驗:取延胡索乙素對照品溶液，進樣5μl，記錄層析圖，結(jié)果見圖1;②精密度試驗:取同一供試品溶液(1號樣品)，連續(xù)進樣5次，記錄層析圖，經(jīng)中藥層析指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)評價后，相似度＞0.95，表明儀器精密度良好;③重現(xiàn)性試驗:取同一批樣品(1號樣品)5份，分別按供試品溶液的制備方法制備供試品并進行測定，經(jīng)中藥層析指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)評價后，相似度＞0.95，表明重現(xiàn)性良好;④穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液(1 號樣品)，分別在0、2、4、6、8、12、24h 進樣，記錄層析圖，經(jīng)中藥層析指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)評價后，相似度＞0.95，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 流動相梯度洗脫程序(%)

圖1 延胡索乙素的層析圖

結(jié) 果

1.指紋圖譜的測定:13批延胡索藥材按上述實驗方法制成供試品溶液，在上述層析條件下，分別進樣并記錄108min層析圖。

2.共有峰的標定:108min內(nèi)共有23個主要特征峰，且均為共有峰，2號樣品的層析圖見圖2。13批延胡索藥材指紋圖譜匹配后的圖譜見圖3。其中19號峰為延胡索乙素，由于14號峰含量最高且比較穩(wěn)定，故將其作為參比峰(S)，計算其他各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表2和表3。13批延胡索藥材層析圖中非共有峰面積占總峰面積的百分比＜6%，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

3.相似度評價:運用“中藥層析指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)”軟件，計算13批延胡索藥材的相似度，結(jié)果見表5。除13號延胡索藥材的相似度為0.926外，其余12批樣品色譜圖與對照指紋圖譜的相似度均＞0.95。

表2 元胡藥材HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表3 元胡藥材HPLC指紋圖譜共有峰的相對峰面積

表4 13批元胡藥材生品相似度結(jié)果

討 論

1.提取溶劑的選擇:分別用濃氨∶甲醇(1∶20)，濃氨∶乙醇(1∶20)，濃氨∶50%甲醇(1∶20)3 種提取溶劑對供試品進行提取。經(jīng)比較，當提取溶劑為濃氨∶甲醇(1∶20)時，層析圖顯示層析峰數(shù)較多且層析峰較高，所以選擇濃氨∶甲醇(1∶20)為提取溶劑。

2.層析柱的選擇:層析柱比較了 YMC－Pack ODS －A(250.0mm ×4.6mm，粒徑5.0μm)和 Thermo hypersil GOLD C18(250.0mm ×4.6mm，粒徑 5.0μm)的分離效果，選擇Thermo hypersil GOLD C18柱。

3.流動相的選擇:流動相A相分別選擇甲醇和乙腈，相同洗脫梯度程序下，經(jīng)比較，流動相A相為甲醇時，層析峰分離度良好。流動相B相pH值分別選擇 4.0、5.0、6.0，經(jīng)比較，當 pH 值為 5.0 時，層析峰形及分離度較好，所以B相pH值選擇5.0。

4.檢測波長的選擇:經(jīng)二極管陣列檢測器，在190～400nm波長檢測，得到三維光譜圖。結(jié)果顯示280nm層析峰形較好，出峰數(shù)目較多，各層析峰之間分離度較好，故選擇280nm作為檢測波長。

5.相似度評價:從表5相似度結(jié)果來看，13批延胡索藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，除13號樣品外，其余都高于0.95，表明該13批延胡索樣品的共有特征峰基本保留，相似度良好。

本實驗建立了延胡索藥材的HPLC指紋譜的測定方法，實驗方法簡便，重復性好，得到延胡索藥材HPLC指紋圖譜及相關數(shù)據(jù)，為延胡索藥材及其他含延胡索的中藥復方制劑制定質(zhì)量標準提供參考。

1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2010:130

2 浙江植物志編輯委員會.浙江植物志(總論)［M］.杭州:浙江科學技術(shù)出版社，1993:256

3 賀凱，高建莉，趙光樹.延胡索化學成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進展［J］.中草藥，2007，38(12):1909－1912

4 謝培山.中藥色譜指紋圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:10

5 周玉新，等.中藥指紋圖譜研究技術(shù)［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2002:131

6 竇志英，孫巍，張敏，等.陜西產(chǎn)延胡索藥材HPLC指紋圖譜研究［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，2007，26(3):150－153

7 游修琪，顧雪竹，毛淑杰，等.延胡索產(chǎn)地不同加工品HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2009，31(10):1481－1484

8 劉梅湯，樹良，張文惠.HPLC色譜指紋圖譜鑒別夏天無和延胡索藥材［J］.中藥材，2003，26(9):629－631

9 施菁，王煒，陳柳蓉.白花土元胡藥材的高效液相色譜法指紋圖譜研究［J］.醫(yī)藥導報，2008，27(9):1108－1110

10 李先端，馬志靜，毛淑杰.不同品種醋制延胡索指紋圖譜的比較研究［J］.中藥材，2007，30(2):144－146

11 程星燁，石鉞.延胡索抗心肌缺血活性部位指紋圖譜中化學成分分析［J］.中國中藥雜志，2008，33(14):1717－1719