漯河地區(qū)食管癌患者癌組織中人乳頭狀瘤病毒感染的檢測

崔明辰 岳鶴聲 張冬云 赫 欣 王建國 宋曉兵

人乳頭狀瘤病毒(HPV)與女性生殖道某些腫瘤、尤其是宮頸癌的發(fā)生關系密切。近年來，有關HPV在食管癌中的研究有大量報道，但結果差別很大。本研究應用PCR法，使用HPV L1基因區(qū)通用引物、HPV16和18型E6基因特異性引物對115例河南省漯河地區(qū)食管癌標本中的HPV感染情況進行檢測和分析，初步探討其與漯河地區(qū)食管癌的相關性，以期為深入認識HPV與食管癌的關系及可能的防治策略提供線索。

材料與方法

1.材料:115例石蠟包埋的河南省漯河地區(qū)食管鱗狀細胞癌術后病理標本，均為2005年1月～2009年3月漯河醫(yī)學高等?？茖W校第二附屬醫(yī)院病理科存檔標本，所有標本經(jīng)10%甲醛溶液固定、石蠟包埋保存，連續(xù)5μm切片。

2.組織塊中全核酸的提取:使用石蠟標本DNA提取試劑盒(凱普生物化學有限公司)，按說明書提示，提取組織全核酸后于－20℃保存。

3.HPV的PCR檢測:使用β－actin作內(nèi)參(PCR產(chǎn)物為290bp)，使用 HPV L1區(qū) GP5+/6+引物、HPV16 E6和HPVl8 E6型特異性引物進行PCR擴增。按HPV GP5+/6［1］以及 HPVl6 E6 和 HPVl8 E6 型特異性引物［2］的擴增條件。PCR中使用了Ex－Taq酶(寶生物，大連)，每個反應總體積為50μl，加入1μl提取的組織全核酸作為模板。陽性對照使用的HPVl6及18全基因組質粒由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所腫瘤病毒室病毒基因工程國家重點實驗室劉宏圖教授惠贈。本研究使用的引物序列及擴增產(chǎn)物的長度見表1。

結 果

1.標本全核酸的提取:標本 DNA提取后，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下進行觀察，從圖1可以明顯看出代表人全核酸的條帶:所提標本DNA約在500bp～20kb處有泳動條帶不等，而人類基因組核酸DNA泳動條帶約為20kb，人類新鮮組織所提DNA泳動條帶約為20kb，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是標本經(jīng)甲醛浸泡或石蠟包埋后使得標本中的DNA發(fā)生了斷裂，出現(xiàn)了較小斷裂DNA片段。

表1 擴增引物序列及擴增產(chǎn)物長度

圖1 提取的組織DNA

2.標本全核酸的質量控制:使用β－actin的內(nèi)參PCR反應對提取的115例標本全核酸進行質量控制，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成，序列為TCACCCAC ACTG TG CCCATCT和GAACCGCTC ATT GCCAATGG。PCR反應總體積為50μl，反應條件為95℃預變性5min，95℃變性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，共進行35個循環(huán)。以293細胞提取全核酸為模板的陽性對照，其產(chǎn)物大小為290bp，提取的食管癌組織全核酸為模板的PCR產(chǎn)物大小與陽性對照相近，說明組織中所提全核酸可滿足進一步實驗要求(圖2)。

3.標本HPV檢測:GP5+/6+是國際上廣泛使用的HPV L1基因區(qū)通用引物，可檢測20多個型別HPV。對115例食管癌樣品進行了PCR檢測，用含有HPV16、18全基因組的質粒作為本組實驗陽性對照，可觀察到約150bp的GP5+/6+擴增產(chǎn)物。與之參照，115例食管癌樣品中，檢測到86例HPV陽性，HPV陽性率為74.8%。同時，我們分別使用HPV16和18兩型別E6基因特異性引物對樣品進行了PCR檢測。有56份樣品檢出HPV16 E6基因，其陽性率為48.7%;20個樣品可檢測到HPV18 E6基因，其陽性率為17.4%;12個樣品同時具有HPVl6和18兩個型別E6基因的擴增子，可以認為這12份樣品是HPV16和18兩個型別的混合感染。HPV16和18總感染率為55.7%(表2)。

表2 河南省漯河地區(qū)食管癌組織中HPV DNA檢測結果

討 論

食管癌是世界上最常見的6大惡性腫瘤之一，也是我國最常見的惡性腫瘤，占我國惡性腫瘤相關死因的第4 位［3］。1982 年 Syrjanen［4］首次提出食管癌形態(tài)學改變與生殖道疣非常相似，認為人乳頭狀瘤病毒和食管癌的發(fā)生可能有關。HPV是一組體積較小的雙鏈DNA病毒，目前已分離了120多種亞型，其中15種高危型HPV的感染已被證明是引起宮頸癌的必要因素［4］。

但是與宮頸癌組織中HPV感染情況不同的是，食管癌組織中HPV感染率在不同的國家、不同的地區(qū)及同一地區(qū)差異極大。劉宏圖教授領銜的研究團隊曾使用HPV6、11、16和18的通用引物，在廣東潮汕地區(qū)檢測過新鮮食管癌切除組織樣品，發(fā)現(xiàn)HPV16和18的分布頻率分別約為40%和20%，檢出率隨不同批次有所改變，兩型別合計存在比率在60%～70%之間變動;應用HPV L1通用引物GP5+/6+、HPV16 E6和HPV18 E6型特異性引物，在河南省林州市食管癌樣品中HPV16和18的檢出率為71.0%［5］。本研究中，漯河地區(qū)石蠟包埋食管癌組織中HPV檢出率為55.7%，低于上述兩地食管癌標本中HPV16、18檢出率，造成這些差異的原因可能與標本來源、病變?nèi)〔牟课?、標本?shù)量、環(huán)境地理因素、遺傳易感性和檢測方法不同有關。本研究確定了我國河南省漯河地區(qū)食管癌組織中有HPV存在，其中HPV16的感染占很大比例，并且HPV感染可能是食管癌發(fā)生的重要病因。這為下一步闡明食管癌多階段演進的分子機制，建立高危人群檢測和早期診斷生物指標和手段奠定了工作基礎。

1 Karlsen F，Kalantari M，Jenkins A，et al.Use of multiple PCR seta for optimal detection of human papillomavirus［J］.J Clin Microbilo，1996，34(2):2095－2100

2 Sotlar K，Diemer D，Dethleffs A，et al.Detection and typing of human papillomavirus by E6 nested multiplex PCR［J］.J Clin Microbiol，2004，42(5):3176 －3184

3 Gao GF，Roth MJ，Wei WQ，et al.No association between HPV infection and the neoplastic progression of esophageal squamous cell carcinoma:Result from a cross－sectional study in a high－risk region of China［J］.Int J Cancer，2006，119(3):1354－1359

4 Zur HH.Cervical carcinoma and human papillomavirus on the road to preventing a major human cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2001，93(6):252－253

5 李淑英，李穎，王立東，等.應用聚合酶鏈反應檢測食管癌組織中人乳頭狀瘤病毒［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，2008，22(3):251－253