甜菜堿的電噴霧質(zhì)譜研究

王佳鈺 ，張婷婷 ，許慶軒 ，孫 暉 ，周 芹 ，吳玉梅

（1.農(nóng)業(yè)部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱150080；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040）

甜菜堿在甜菜糖蜜中首先發(fā)現(xiàn)并因此得名。它是一種高效甲基供體，能調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓、促進(jìn)脂肪代謝和蛋白質(zhì)合成。由于對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)有多種作用[1－2]，因此主要應(yīng)用于飼料。另外，甜菜堿具有多種藥理作用[3－4]，在醫(yī)藥行業(yè)也有廣闊的前景。甜菜堿的檢測(cè)主要有分光光度法[5－6]和高效液相色譜法[7－8]。但是分光光度法定性能力較差，甜菜堿的紫外吸收波長(zhǎng)較?。ㄔ?92nm處最大吸收），容易受雜質(zhì)及溶劑干擾。高效液相色譜法對(duì)前處理要求較高，工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力。電噴霧質(zhì)譜技術(shù)不需要復(fù)雜的前處理，在生物及天然產(chǎn)物分析中有著廣泛的應(yīng)用[9-12]，生物堿一般具有堿性和高質(zhì)子親核勢(shì)，在電噴霧質(zhì)譜中容易電離，因此具有很好的靈敏度和重現(xiàn)性，串聯(lián)質(zhì)譜給出化合物的結(jié)構(gòu)信息，大大提高了定性能力[13-16]。

甜菜堿又稱三甲基甘氨酸，系一種季胺型生物堿，分子中含有一個(gè)羧基和一個(gè)氨基，因此甜菜堿具有很高的質(zhì)子親核勢(shì)，適合在正離子模式下檢測(cè)。本文采用簡(jiǎn)單的前處理方法獲得糖甜菜提取液，使用電噴霧質(zhì)譜法很容易獲得其正離子模式的質(zhì)譜圖，在其中選擇與甜菜堿質(zhì)核比相同的質(zhì)譜峰碰撞誘導(dǎo)解離，將其與甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品的串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行對(duì)照，就可以很方便地鑒定出甜菜堿。本方法不需要復(fù)雜的前處理，具有很高的靈敏度和重現(xiàn)性，串聯(lián)質(zhì)譜給出的結(jié)構(gòu)信息可以對(duì)甜菜堿定性，因此本方法可以作為復(fù)雜體系中甜菜堿的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

實(shí)驗(yàn)材料：糖甜菜塊根，栽培品種，由中國(guó)農(nóng)科院甜菜研究所提供。

儀器設(shè)備：電噴霧質(zhì)譜儀為ThermoFisher LCQ fleet（Thermo Fisher Scientific公司），氦氣為緩沖氣和碰撞氣，使用電噴霧源，正離子模式。儀器條件優(yōu)化如下：鞘氣（sheath gas，氮?dú)猓┝魉伲?0arbitrary units；噴霧電壓（ion spray voltage）：4.0kV；毛細(xì)管溫度（capillary temperature）：180℃；毛細(xì)管電壓（capillary voltage）：44V；套管透鏡補(bǔ)償電壓（tube lens offset）：50V；注射泵（syringe pump）進(jìn)樣，進(jìn)樣速度為 5μL/min；碰撞能量 25%。

主要試劑為甲醇（色譜級(jí)，迪馬公司），去離子水（Milli-Q純水機(jī)制備），甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于SIGMA公司，甲酸、氨水均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜菜堿的電噴霧質(zhì)譜研究 a）甜菜堿電噴霧質(zhì)譜分析條件的研究：將甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解于甲醇/水（50∶50），甲醇/水/甲酸（50∶50∶0.5），甲醇/水/氨（50∶50∶0.5）中制成 0.0001%的甜菜堿溶液，將此溶液用于電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，注射泵流速5μL/min。b）甜菜堿電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜研究：根據(jù)1.2.1中a）實(shí)驗(yàn)選擇合適的甜菜堿電噴霧檢測(cè)條件，用于串聯(lián)質(zhì)譜研究，優(yōu)化能量，使串聯(lián)質(zhì)譜處于最佳狀態(tài)。

1.2.2 糖甜菜中甜菜堿的檢測(cè) 取糖甜菜鮮樣使用鋸糊機(jī)制成糊狀，取10g甜菜糊分別用30mL水提取2次，合并提取液過(guò)濾，加入60mL甲醇攪拌，靜止1h，過(guò)濾，加入甲酸配成0.5%甲酸溶液，直接用于電噴霧質(zhì)譜分析，并選擇與甜菜堿相同質(zhì)核比的峰進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜研究。

2 結(jié)果與討論

甜菜堿在電噴霧負(fù)離子模式下沒(méi)有信號(hào)，但是在正離子模式下信號(hào)很強(qiáng)。圖1展示了甜菜堿在中性、堿性、酸性溶液的正離子電噴霧質(zhì)譜。通常生物堿的質(zhì)子親核勢(shì)較高，在電噴霧條件下容易形成質(zhì)子化分子。圖 1a 中，我們可以看出，在中性條件下，甜菜堿極易出現(xiàn)[M+H]+（m/z118）峰、[M+Na]+（m/z140）峰和[M+K]+（m/z156）峰，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生聚合現(xiàn)象，其聚合物也以加H、Na、K峰的形式出現(xiàn)。從總的趨勢(shì)來(lái)看，這些峰的強(qiáng)度呈現(xiàn)正態(tài)分布，也就是隨著聚合度的增加其強(qiáng)度也增加，在四聚體的情況下達(dá)到最強(qiáng)，之后隨聚合度增加峰的強(qiáng)度呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)。說(shuō)明甜菜堿在中性條件容易聚合，四聚體處于空間結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定狀態(tài)，在這個(gè)區(qū)間聚合物只要表現(xiàn)為電荷吸引作用，空間排斥效應(yīng)較小，之后隨著聚合度的增加空間排斥效應(yīng)逐漸變大，其穩(wěn)定性逐漸降低，因此峰強(qiáng)度逐漸減弱。另外，甜菜堿加H、Na、K峰的強(qiáng)度表現(xiàn)為加H峰>加Na峰>加K峰，說(shuō)明甜菜堿及其聚合物容易和半徑小的離子結(jié)合。但是在四聚體的情況下加Na峰最強(qiáng)，說(shuō)明鈉離子半徑適當(dāng)，在四聚的情況下空間位阻最小。在通常情況下，堿性條件能夠抑制正離子，因此不利于電噴霧正離子的形成。如圖1b所示在堿性條件下，加Na及加K離子受到嚴(yán)重抑制，但是加H峰仍然很強(qiáng)，說(shuō)明甜菜堿的質(zhì)子親核勢(shì)很強(qiáng)，堿性條件對(duì)電噴霧質(zhì)譜加氫離子抑制有限。在堿性條件下甜菜堿也存在聚合現(xiàn)象，但是這種聚合能力與中性條件下相比大大降低，并且聚合度越高穩(wěn)定性也越差，峰的強(qiáng)度也隨之降低。同樣在酸性條件下，也只出現(xiàn)了[M+H]+峰（如圖1c所示），這是由于氫離子的含量增多，競(jìng)爭(zhēng)甜菜堿的能力大大高于鈉、鉀離子導(dǎo)致的。在堿性條件下氫氧根離子與甜菜堿共同競(jìng)爭(zhēng)陽(yáng)離子從而導(dǎo)致加甜菜堿加Na及加K離子消失，這就是在酸性和堿性條件下甜菜堿離子化的差別。另外，在酸性條件下，甜菜堿聚合物的強(qiáng)度很小，說(shuō)明酸性條件嚴(yán)重影響甜菜堿的聚合。甜菜堿是兩性化合物，含有酸堿兩個(gè)活性集團(tuán)，在中性條件下含有正、負(fù)電荷的兩個(gè)活性位點(diǎn)，在酸性或堿性條件下只存在一個(gè)活性位點(diǎn)，在酸、堿條件下甜菜堿聚合能力降低，說(shuō)明甜菜堿分子之間的聚合是由兩個(gè)活性位點(diǎn)的正、負(fù)電荷相互吸引導(dǎo)致的。另外，這種聚合物的穩(wěn)定性與甜菜堿的聚合度以及加和離子的大小也有很大關(guān)系（如圖1a所示），說(shuō)明空間效應(yīng)對(duì)聚合有很大影響，也證明了這種聚合是非線型的，環(huán)型聚合的可能性最大。

選擇甜菜堿的加氫離子（m/z118）做串聯(lián)質(zhì)譜，譜圖如圖2所示，在二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜中，m/z118的母離子丟失60、59Da的中性碎片，分別產(chǎn)生m/z58、59的子離子，甜菜堿的兩個(gè)子離子的質(zhì)量奇偶不同，這是甜菜堿在電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜中典型特征。說(shuō)明一個(gè)子離子含有氮原子，另一個(gè)子離子則不含氮原子，并且含氮原子的子離子峰比較強(qiáng)，也就可以推出羧基和氮原子之間碳氮鍵容易斷裂，其碎裂機(jī)理如圖3所示。

圖4為糖甜菜水提取液的電噴霧質(zhì)譜圖，盡管沒(méi)有經(jīng)過(guò)復(fù)雜的前處理，提取液所含成分很多，但是m/z118峰仍然比較明顯，對(duì)m/z118離子做串聯(lián)質(zhì)譜，所得譜圖與圖2相同 （圖略），因此可以證明該峰就是甜菜堿的質(zhì)譜峰。

3 結(jié)論

甜菜堿在水溶液中容易聚合，但是酸堿可以通過(guò)減少其電荷位點(diǎn)抑制其聚合。在電噴霧質(zhì)譜中甜菜堿不僅能和質(zhì)子加和，還能夠和鈉離子和鉀離子結(jié)合。在我們的研究中甜菜中多種化合物與甜菜堿一樣能夠和金屬離子結(jié)合，這可以解釋甜菜能夠耐鹽堿脅迫機(jī)制。在酸性條件下，甜菜堿的電噴霧質(zhì)譜圖比較簡(jiǎn)單，容易解析，為最佳檢測(cè)條件。甜菜堿的質(zhì)子親核勢(shì)高，適合電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，甜菜提取液不需復(fù)雜的前處理就可以檢測(cè)出甜菜堿，其特征的碎裂方式為該化合物的定性提供堅(jiān)實(shí)的依據(jù)，用電噴霧質(zhì)譜法檢測(cè)甜菜堿具有靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，快速等優(yōu)點(diǎn)，可以作為復(fù)雜體系中甜菜堿快速檢測(cè)的絕佳方法。

[1]蔡娟，吳天華.甜菜堿的營(yíng)養(yǎng)作用和應(yīng)用效果[J].四川畜牧獸醫(yī)，2002（29）：60-64.

[2]吳萬(wàn)福，李萍，占秀安.甜菜堿的營(yíng)養(yǎng)作用及機(jī)理研究進(jìn)展[J].中國(guó)飼料，1999（6）：9-10.

[3]Balkan J，Oztezcan S，Kucuk M，Cevikbas U，Kocak-Toker N，Uysal M.The effect of betaine treatment on triglyceride levels and oxidative stress in the liver of ethanol-treated guinea pigs[J].Exp Toxicol Pathol，2004，55（6）：505-509.

[4]徐中南，謝梅林，陸倫根，等.甜菜堿對(duì)大鼠酒精性脂肪肝的影響[J].肝臟，2006，11（3）：163-166.

[5]李優(yōu)琴，高家驊，周維仁.比色法測(cè)定合成甜菜堿的含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，15（2）：127-128.

[6]周芹，吳玉梅，胡曉航.比色法測(cè)定甜菜塊根中甜菜堿含量[J].中國(guó)糖料，2008（4）：27-28.

[7]陳少良，畢望富，李金克.反相HPLC離子對(duì)色譜法測(cè)定植物組織中的甜菜堿[J].植物學(xué)報(bào)，2000，42（10）：1014-1018.

[8]楊昕，Clive Barwell，劉焱文.高效液相色譜法測(cè)定4種海藻中甜菜堿的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2001，8（2）：35-36.

[9]Mclafferty，F(xiàn).W.；Fridriksson，E.K.；Horn，D.M.；Lewis，M.A.；Zubarey，R.A.Techview：Biochemistry.Biomolecule Mass Spectrometry[J].Science，1999，284（5418）：1289-1290.

[10]Wilm，M.；Shevchenko，A.；Houthaeve，T.Femtomole Sequencing of Proteins from Polyacrylamide Gels by Nano-Electrospray Mass Spectrometry[J].Nature，1996，379（6564）：466-469.

[11]Liu，S.Y.；Cui，M.；Liu，Z.Q.；Song，F(xiàn).R.Structural Analysis of Saponins from Medicinal Herbs Using Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry[J].J Am Soc Mass Spectrom.，2004，15（2）：133-141.

[12]Chai，W.；Piskarev，V.；Lawson，A.M.Negative-Ion Electrospray Mass Spectrometry of Neutral Underivatized Oligosaccharides[J].Anal.Chem.，2001，73（3）：651-657.

[13]Qingxuan Xu，Yong Wang，Zhiqiang Liu and Shuying Liu.Structure Identification of Five Unknown Dilipo-alkaloids Extracted from Processed Tuber of Aconitum Carmiechaeli by Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometr[J].Analytical Sciences，2003，19（12）：1599-1603.

[14]Qing Xuan XU，Li LI，Zhi Qiang LIU，Ming Quan GUO，Shu Ying LIU*.Analysis of Norditerpenoid Alkaloids Extracted from Aconitum sinomantanum NakaibyElectrosprayIonizationTandem MassSpecmetry[J].Chem.Res.Chinese，U.， 2006，22（3）：343-346.

[15]Y.Wang，Q.X.Xu，F(xiàn).R.Song，Z.Q.Liu，and S.Y.Liu.A new method for preparation and charcterization of lipo-alkaloid[J].Chem.Res.Chinese U.，2004，20（1）：121-123.

[16]Y.Wang，F(xiàn).R.Song，Q.X.Xu，Z.Q.Liu，and S.Y.Liu.Characterization of aconitine-type alkaloids in the flowers of Aconittum kusnezoffi by electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].J.Mass Spectrom.，2003，38（9）：962-970.