CIK細(xì)胞治療乳腺癌的臨床療效評(píng)估

解燕華，左 鐵，孟明耀，劉運(yùn)洪，鄭建平，金醒昉，侯宗柳

（昆明市延安醫(yī)院，云南 昆明 650051）

多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokines induced killers,CIK） 是一類由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的具有T細(xì)胞的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤特點(diǎn)。1991年由斯坦福大學(xué)的Schmidt-Wolf等報(bào)道后，現(xiàn)成為免疫治療多種惡性腫瘤應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞治療之一[1]。CIK細(xì)胞應(yīng)用于臨床需要足夠數(shù)量的細(xì)胞及良好的活性和細(xì)胞毒作用。但CIK細(xì)胞對(duì)乳腺癌的臨床治療效果有待于進(jìn)行系統(tǒng)地臨床觀察。本研究對(duì)細(xì)胞增殖規(guī)律、細(xì)胞表型和細(xì)胞毒作用進(jìn)行研究，同時(shí)進(jìn)行近期臨床療效、免疫反應(yīng)及不良反應(yīng)的觀察。

材料和方法

一、研究對(duì)象：35例乳腺癌患者進(jìn)行CIK細(xì)胞治療（最大年齡82歲，最小31歲，平均年齡56.57歲）。入組標(biāo)準(zhǔn)，組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為乳腺癌患者，接受過乳腺癌的規(guī)范化治療包括手術(shù)、化療，末次治療至開始接受CIK治療的間隔時(shí)間為4周；無法進(jìn)行手術(shù)、放療、化療的中晚期患者，患者預(yù)期生存＞3個(gè)月；PS評(píng)分≧60分，無嚴(yán)重的病毒、細(xì)菌感染。本研究獲本單位倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者或由其法定代理人簽署了知情同意書，同意進(jìn)行此免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)，正在接受放療、化療或其他全身抗腫瘤治療者；同時(shí)存在其他惡性腫瘤及傳染性疾病者；大手術(shù)傷口未完全愈合者；懷孕期或哺乳期婦女；存在違反本試驗(yàn)的體檢或?qū)嶒?yàn)室異常者；對(duì)生物制品過無敏反應(yīng)者。

二、材料：RPMI1640購(gòu)自美國(guó)Gibco公司?？谷薈D3單克隆抗體（Anti-CD3 mAb） 購(gòu)自北京市晶美基因谷科技有限公司。IL-2購(gòu)自江蘇金絲利有限公司。IFN－γ購(gòu)自上?？寺∩锔咝录夹g(shù)有限公司。流式試劑CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP，CD3 FITC/CD56PE/CD45PerCP購(gòu)自美國(guó)BD公司。胎牛血清購(gòu)自HyClone公司。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津瑞灝生物制品科技有限責(zé)任公司。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD Calibur FACSTM。酶標(biāo)分光光度計(jì)為美國(guó)Bio-Rad Model-680。二氧化碳孵箱為美國(guó)Forma SeriesⅡModel 3111。BEL-7404人肝癌細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供。

三、方法：1.CIK細(xì)胞培養(yǎng) 淋巴細(xì)胞提取，采用Ficoll離心分離，將分離的細(xì)胞密度調(diào)至1×109/L。分別懸于傳統(tǒng)RPM I1640培養(yǎng)基 （RPM I1640＋100ml/L FBS，2mmol/L谷氨酰胺，100μg/L青霉素，100μg/L鏈霉素） 和改良RPMI1640培養(yǎng)基（RPM I1640，100ml/L FBS，2mmol/L谷氨酰胺，100μg/L青霉素，100μg/L鏈霉素，HEPES 20mmol/L，丙酮酸鈉8mmol/L，β－巰基乙醇20μmol/L，適量的核苷酸和脫氧核苷酸），加入IFN－γ 1000U/ml，37℃，5%CO2，培養(yǎng)24h后，再加入抗人CD3mAb，50ng/ml，IL-21000U/ml 37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)9～12d行體外細(xì)胞表型和細(xì)胞增殖檢測(cè)。

2.細(xì)胞增值數(shù)量和表型測(cè)定 于培養(yǎng)當(dāng)天及9～12d用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量，同時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞CD3+CD56+。方法參照文獻(xiàn)[2]。

3.CIK細(xì)胞體外殺傷活性分析 取培養(yǎng)12d患者的CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞為BEL-7404人肝癌細(xì)胞，按效靶比16∶1、8∶1、4∶1比例加入96孔培養(yǎng)板中，另設(shè)單獨(dú)靶細(xì)胞組和單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞組作為對(duì)照，在37℃，5%CO2培養(yǎng)48h后，棄未貼壁的死細(xì)胞，用1640培養(yǎng)液洗3次，加入5mg/ml MTT 50μl/孔，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，然后每孔加入100μl DMSO溫育至結(jié)晶溶解，在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞毒活性[3,4]。

4.免疫治療計(jì)劃 每位患者在接受其他標(biāo)準(zhǔn)治療后4周，在完善治療前基線評(píng)估后，靜脈回輸CIK細(xì)胞，每次近似于2×109個(gè)，總體100ml，每3～5次為一療程。根據(jù)患者病情，每個(gè)患者進(jìn)行3～4個(gè)療程治療。在完成上述規(guī)定治療后，所有患者在接受治療后即開始進(jìn)入隨訪期。

5.療效評(píng)價(jià)與觀察指標(biāo) 主要終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)為無腫瘤進(jìn)展時(shí)間，次要終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)為近期療效和不良事件。無腫瘤進(jìn)展時(shí)間定義為：接受免疫治療起到腫瘤進(jìn)展時(shí)間。臨床療效評(píng)價(jià)：若有可評(píng)價(jià)病灶的患者的臨床療效評(píng)定，按照衛(wèi)生部頒布的實(shí)體瘤客觀療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。完全緩解(CR)：瘤體完全消失持續(xù)至少4周以上；部分緩解(PR)：腫瘤最大直徑減少50%以上，持續(xù)至少4周；病情穩(wěn)定(SD)：腫瘤增大或縮小均不超過25%，無新病灶；病情進(jìn)展(PD)：腫瘤增長(zhǎng)大于25%或出現(xiàn)新的病灶。完全緩解+部分緩解為近期有效率，完全緩解+部分緩解+病情穩(wěn)定為疾病控制率。若無可評(píng)價(jià)病灶的患者影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移則為病情進(jìn)展(PD)。接受治療后第4周、第8周評(píng)價(jià)近期臨床療效，復(fù)查胸部CT，評(píng)估臨床癥狀，血常規(guī)、血生化常規(guī)等；如懷疑有腫瘤轉(zhuǎn)移，加做相關(guān)檢查。

6.免疫學(xué)評(píng)價(jià) 接受治療后2周末，評(píng)價(jià)12例患者治療前后外周血中CD3+，CD4+，CD8+，CD56+的變化。

7.不良事件 依據(jù)美國(guó)國(guó)立癌癥研究所制定的通用藥物毒性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，將各種不良事件分為0～Ⅳ度，Ⅰ度+Ⅱ度+Ⅲ度+Ⅳ度為毒性反應(yīng)發(fā)生率。

8.隨訪 所有患者在療效評(píng)價(jià)之后每3個(gè)月隨訪1次，行相關(guān)檢查。如懷疑有腫瘤轉(zhuǎn)移，加做相關(guān)檢查。病情進(jìn)展的患者接受其他治療方案，仍然接受隨訪。截止時(shí)間為2010年3月31日。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包處理，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD） 表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞增殖結(jié)果：在CIK細(xì)胞分離培養(yǎng)3～6d細(xì)胞增值較慢，但是當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)9d以后細(xì)胞增殖明顯，是一個(gè)快速增殖的過程，在12d以后達(dá)到了442.66±85.27。

二、細(xì)胞表型：CIK細(xì)胞在培養(yǎng)12d以后，CD3+CD56+達(dá)到了33%以上，在15～18d之后達(dá)到了50%左右。說明培養(yǎng)的CIK細(xì)胞能得到純度很高的細(xì)胞。

三、細(xì)胞毒活性：效靶比為4∶1、8∶1、16∶1時(shí)，細(xì)胞毒活性分別為37.13±11.44、56.91±10.43和77.06±11.62，其中效靶比為16∶1時(shí)細(xì)胞毒活性最大。

四、臨床療效評(píng)價(jià)：35例患者隨訪時(shí)間為3～15個(gè)月，患者普遍在輸注CIK細(xì)胞后精神癥狀好，同時(shí)增強(qiáng)食欲、改善睡眠、增強(qiáng)體力，增加體重。35例患者中，Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期11例，失訪3例。所有的患者均為手術(shù)后實(shí)行CIK治療，20例治療了2個(gè)療程以上。最長(zhǎng)隨訪時(shí)間為31月，中期隨訪時(shí)間為15個(gè)月。近期療效評(píng)價(jià)中，完全緩解24例，部分緩解6例，病情穩(wěn)定1例，近期有效率為85.71%，疾病控制率為88.57%，無腫瘤進(jìn)展時(shí)間為2～31個(gè)月，中位無腫瘤進(jìn)展時(shí)間為15個(gè)月。

五、免疫學(xué)療效評(píng)價(jià)：治療結(jié)束后2周末，所有患者CD3+，CD4+，CD8+均較治療之前有明顯升高（P≤0.001），提示該療法提高了患者體內(nèi)的CD3+CD4+，CD8+基礎(chǔ)水平，可誘導(dǎo)患者產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，見附表。

附表 CIK治療乳腺癌前后的免疫學(xué)療效評(píng)價(jià)

六、不良事件分析：在接受CIK細(xì)胞過繼免疫治療的35例患者中，依據(jù)美國(guó)國(guó)立癌癥研究所制定的通用藥物毒性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，并未出現(xiàn)Ⅲ度+Ⅳ度的嚴(yán)重不良反應(yīng)。1例出現(xiàn)一過性發(fā)熱反應(yīng)。

討 論

免疫細(xì)胞過繼療法已成為放、化療后，對(duì)腫瘤患者進(jìn)行輔助治療的重要手段之一，對(duì)于促進(jìn)患者免疫系統(tǒng)的重建、消除殘留病變，以及骨髓凈化都具有良好的效果。CIK細(xì)胞是一類由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)表明，其具有較好的擴(kuò)增性能和很強(qiáng)的腫瘤殺傷活性[5,6]，而對(duì)于自身組織則沒有細(xì)胞毒作用，但將其應(yīng)用于臨床，必須有足夠的數(shù)量和較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。我們培養(yǎng)中采用最常用的細(xì)胞因子組合：IFN-γ＋CD3＋I(xiàn)L-2刺激誘導(dǎo)CIK細(xì)胞增殖，結(jié)果表明，細(xì)胞純度在12達(dá)到34.44%左右，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。細(xì)胞毒活性，CIK細(xì)胞培養(yǎng)13d后，對(duì)BEL-7404細(xì)胞殺瘤率平均是77.06±11.62，達(dá)到了較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。

本研究中對(duì)35例乳腺癌患者治療后臨床療效主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是大多數(shù)病例經(jīng)過手術(shù)、化療等治療的同時(shí)或之后，輸注CIK細(xì)胞治療可以在不損傷機(jī)體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步達(dá)到清除體內(nèi)殘留癌細(xì)胞的目的；二是該療法提高了患者體內(nèi)的CD3+CD4+基礎(chǔ)水平，可誘導(dǎo)患者產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，大大提高患者自身免疫力。三是一定程度上減輕病人的痛苦，提高生活質(zhì)量，同時(shí)增強(qiáng)食欲、改善睡眠、增強(qiáng)體力，增加體重。

CIK細(xì)胞療法既可應(yīng)用于乳腺癌的治療，對(duì)于手術(shù)切除、化療等治療的同時(shí)或治療后的病人療效更佳。并且還能調(diào)節(jié)和增強(qiáng)全身免疫機(jī)能，在體內(nèi)長(zhǎng)期發(fā)揮抗腫瘤的活性，除可以消滅體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞外，還可防止腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。更重要的是，CIK細(xì)胞療法對(duì)人體正常細(xì)胞、機(jī)體免疫系統(tǒng)沒有任何傷害，是一種安全可靠、無副作用的腫瘤治療方法。此外，CIK細(xì)胞療法在內(nèi)科治療的基礎(chǔ)上，對(duì)無法進(jìn)行手術(shù)、晚期和高齡患者進(jìn)行聯(lián)合治療，從而達(dá)到延長(zhǎng)患者生命的目的。

［1］SCHMIDT-WOLF GD,NEGRIN RS,SCHMIDT-WOLF IG.Actived T cells and cytokine-induced CD3+CD56+killer cells[J].Annals ofHematology,1997,74:51-56.

［2］潘春華,羅榮城.CIK細(xì)胞的表型分析及生物學(xué)活性研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2003,28(11):1030-1032.

［3］任歡,徐紅薇.CIK細(xì)胞的體外增殖及殺瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,1998,14(6):406-408.

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［5］SCHMIDT-WOLF IG,LEFTEROVA P,JOHNSTON V,et al.Propagation of large numbers of T cells with natural killercell markers[J].Br J Haematol,1994,87(3):453.

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