過氧化物酶體增殖激活受體γ或α在改善HepG2細(xì)胞糖代謝中的作用

宋璐璐 ，蕭建中，邢小燕 ，張 敏，楊文英*

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 研究生院，北京 100730；2.中日友好醫(yī)院 內(nèi)分泌與代謝病中心，北京 100029；3.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 研究生院，北京 100091）

過氧化物酶體增殖激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）家族是一組經(jīng)典的核受體，參與細(xì)胞能量代謝、炎癥、增殖及分化的控制，尤其是糖脂的代謝。其中PPAR-α和PPAR-γ與代謝的關(guān)系更為密切。PPAR-γ主要在脂肪組織表達(dá)，也在肝臟、骨骼肌、胰腺及其它組織低表達(dá)[1]。主要調(diào)節(jié)脂質(zhì)儲(chǔ)存，促進(jìn)糖代謝，抑制炎癥及誘導(dǎo)脂聯(lián)素的合成與分泌[2]。PPAR-α主要在脂代謝活動(dòng)旺盛的組織表達(dá)，如肝臟、脂肪、肌肉等[3]，是脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)元件，參與脂肪酸代謝的調(diào)控，增加脂肪酸線粒體攝取和β氧化的基因表達(dá)，并且促進(jìn)肝臟糖原合成和酮體的生成，參與脂蛋白的組裝。在心臟，PPAR-α還參與糖脂代謝轉(zhuǎn)換的調(diào)控[4]。

關(guān)于PPAR-γ或PPAR-α在人肝細(xì)胞糖代謝中所扮演的角色，尚缺乏直接的證據(jù)。HepG2細(xì)胞是一種常用的肝癌細(xì)胞株，兼具肝細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的特征，能夠表達(dá)多種肝臟特異的功能，因此被用于研究肝細(xì)胞生理或者作為肝細(xì)胞代謝研究的體外模型，也是生物人工肝的細(xì)胞源之一，本研究探討PPAR-α和PPAR-γ受體在HepG2細(xì)胞糖代謝調(diào)節(jié)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

WY14643，吡格列酮和棕櫚酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；牛血清白蛋白（不含游離脂肪酸）購(gòu)自德國(guó)Cabiochem公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒（北京康泰臨床檢驗(yàn)試劑）；丙酮酸測(cè)定試劑盒和乳酸測(cè)定試劑盒 （南京建成生物科技有限公司）；Trizol（Invitrogen，美國(guó)），Real time-qPCR 試劑盒（Toyobo，日本）。WY14643和吡格列酮溶于二甲基亞砜，棕櫚酸按6.8：1的比例與不含游離脂肪酸的牛血清白蛋白共軛耦合。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞在5%C02、37℃條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素和1g/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞復(fù)蘇傳至第3代后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.3 葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)

以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%密度后更換為含胰島素（10-7M）的無血清無酚紅低糖（1g/L）DMEM培養(yǎng)基，分別加入吡格列酮（10μM），WY14643（10μM），每組設(shè) 6 個(gè)平行孔，每孔100μl培養(yǎng)基，孵育24h后以葡萄糖氧化酶法測(cè)定培養(yǎng)基上清中葡萄糖濃度，計(jì)算絕對(duì)葡萄糖消耗量。然后每孔加入20μl MTT試劑，37℃孵育4h，DMSO充分溶解后測(cè)定吸光度，以此代表細(xì)胞活力，計(jì)算相對(duì)葡萄糖消耗量（絕對(duì)葡萄糖消耗量/細(xì)胞活力）。

1.4 胰島素抵抗（IR）模型

IR的細(xì)胞模型建立參照文獻(xiàn)[5]。HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%融合，更換含高濃度FFA（0.5 mmol／L）的低糖 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，于4℃條件下用預(yù)冷0.01mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞3次，即成為具有IR的細(xì)胞模型，測(cè)定培養(yǎng)液中葡萄糖含量作為模型鑒定指標(biāo)。模型建立后，分別用吡格列酮（10μM），WY14643（10μM），測(cè)定胰島素刺激后的葡萄糖消耗量。

1.5 糖酵解產(chǎn)物測(cè)定

細(xì)胞種于96孔板，24h后無血清無酚紅無丙酮酸鈉的低糖DMEM培養(yǎng)基，分別加入吡格列酮（10μM），WY14643（10μM），繼續(xù)孵育 24h，檢測(cè)培養(yǎng)基中丙酮酸和乳酸含量。另外將細(xì)胞種于12孔板，每組設(shè)6個(gè)平行孔，給予藥物處理24h后，以胰酶收獲各瓶中全部細(xì)胞。離心，僅保留細(xì)胞沉淀，加入低滲鹽溶液，使各樣品細(xì)胞終濃度均為1×106／m1，反復(fù)凍融3次，用超聲波振蕩器處理1min，離心后保留上清，測(cè)定丙酮酸和乳酸含量。

1.6 總RNA提取和RT-qPCR

細(xì)胞種于12孔板，分別給予不同藥物處理24h后，收集細(xì)胞提取總RNA。將1g總RNA，65℃變性5min，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)糖酵解相關(guān)基因醛縮酶（ENO1），磷酸果糖激酶（PFKL），磷酸甘油酯激酶（PGK1）和丙酮酸激酶（PKM2）的mRNA表達(dá)。采用NCBI在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，序列如下：PPAR-γ正義引物5'-CAG CCA CCC ACT GTT CAT CAT-3'，反義引物5'-CGG AAT GCA CCA TGC ACT T-3'；PPAR-α 正義引物 5'-ATG GGT ATT GGT CCT GTC CCT-3'，反義引物5'-TCC TGC TTT CTT CAG TGC CC-3'；ENO1正義引物 5'-GCT CTA GCT TTG CAG TCG TG-3'，反義引物5'-TGA GGC GAG AAA AAC AAT GA-3'；PFKL 正義引物 5'-GTCCGCAGCACTCAGACTACG-3'，反義引物5'-GTT GTT GCT GAT GGT GGC TG-3'；PGK1正義引物 5'-AGC CCA CAG CTC CAT GGT AG-3'，反義引物5'-TCA AAA ACC CAC CAG CCT TCT'；PKM2 正義 引物 5'-GCCATGGCTGACACATTCCT-3'，反義引物5'-TGAATCAATGTCCAGGCGG-3'。Real-Time PCR條件：95℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 45s，40 個(gè) 循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參照。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件統(tǒng)計(jì)，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 吡格列酮和WY14643對(duì)PPAR-γ或PPAR-α表達(dá)的影響

吡咯列酮組PPAR-γmRNA表達(dá)與對(duì)照組相比增加7%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。WY14643組PPAR-α表達(dá)輕度減低（11%），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 吡格列酮和WY14643均增加葡萄糖消耗

各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)細(xì)胞活力測(cè)定校正后，吡格列酮組HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量增加了150%（P＜0.01），WY14643 組增加了 20%（P＜0.05）。

圖1示，IR模型組HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量較正常組明顯減少，約為正常組的40%（P＜0.01），吡咯列酮明顯增加葡萄糖的消耗，較模型組增加 1.4 倍（P＜0.01），WY14643 組葡萄糖消耗量較模型組增加 45%（P＜0.05）。

2.3 PPAR-γ對(duì)HepG2糖酵解基因表達(dá)的調(diào)控

HepG2細(xì)胞糖代謝以糖酵解途徑為主，因此我們檢測(cè)了4個(gè)糖酵解相關(guān)基因。圖2示，吡格列酮顯著上調(diào)PFKL、PGK1和PKM2的表達(dá)，分別比對(duì)照組增加7.7倍、4.5倍和4.2倍（P＜0.05）；WY14643處理組，ENO1和PKM2基因表達(dá)輕度上調(diào)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 吡格列酮、WY14643對(duì)糖酵解的影響

圖3示，吡格列酮處理后，相比空白組，培養(yǎng)液上清中丙酮酸水平和乳酸水平分別升高了69%和120%，細(xì)胞內(nèi)丙酮酸水平和乳酸水平分別提高了72%和89%，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外糖酵解產(chǎn)物水平變化一致。WY14643對(duì)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外丙酮酸和乳酸水平均無顯著影響。

3 討論

PPAR-α和PPAR-γ擁有許多共同的靶點(diǎn)，也有各自獨(dú)立調(diào)控的基因群。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，噻唑烷二酮增強(qiáng)多個(gè)靶器官的胰島素敏感性，上調(diào)肝臟胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因表達(dá)，減輕胰島素抵抗，并減少肝糖輸出。體外研究發(fā)現(xiàn)，HepG2表達(dá)PPAR-γ，PPAR-γ 激動(dòng)劑多對(duì) PPAR-γmRNA 的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著影響，與本研究的結(jié)果一致；其主要效應(yīng)表現(xiàn)為強(qiáng)烈誘導(dǎo)PPAR-γ活化[6，7]。

本研究觀察了 PPAR-α和 PPAR-γ在HepG2細(xì)胞糖代謝中扮演的角色。PPAR-α激動(dòng)劑和PPAR-γ激動(dòng)劑都增加HepG2細(xì)胞葡萄糖的消耗量，并且不同程度地改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗；吡格列酮部分通過上調(diào)糖酵解相關(guān)基因增加葡萄糖消耗，而WY14643并調(diào)節(jié)HepG2糖酵解。

PPAR-γ激動(dòng)劑增加糖酵解產(chǎn)物丙酮酸和乳酸生成。糖酵解是HepG2細(xì)胞糖代謝的起點(diǎn)，因此直接影響其他代謝途徑的調(diào)控[8]。丙酮酸和乳酸水平升高有可能有3種機(jī)制：葡萄糖攝入增加，糖酵解增強(qiáng)以及糖酵解利用減少。本研究中吡格列酮促進(jìn)HepG2葡萄糖的消耗，Kim等[9]人報(bào)道TZDs上調(diào)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞GLUT2基因表達(dá)，增加葡萄糖的攝取。本研究檢測(cè)了糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PPAR-γ激動(dòng)劑至少上調(diào)3種參與糖酵解的基因表達(dá)，表明PPAR-γ激動(dòng)劑也促進(jìn)HepG2細(xì)胞糖酵解。

PPAR-α主要和脂質(zhì)代謝有關(guān)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPAR-α激動(dòng)劑能夠改善胰島素抵抗，降低血糖[10，11]，但在臨床研究中沒有得到同樣的結(jié)果[12]。本研究表明，激動(dòng)劑輕度增加HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗，并改善胰島素抵抗，但對(duì)糖酵解基因的誘導(dǎo)和糖酵解途徑的激活沒有作用。PPAR-α激活可能調(diào)節(jié)葡萄糖攝取或其他代謝途徑，有文獻(xiàn)報(bào)道PPAR-α激動(dòng)劑GW7467促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞葡萄糖的攝取[13]。

PPAR-γ和PPAR-α在肝細(xì)胞及心肌細(xì)胞的作用與在脂肪細(xì)胞的作用完全不同。羅格列酮對(duì)分化成熟的人脂肪細(xì)胞GLUT4表達(dá)無明顯作用，對(duì)其糖攝取和糖酵解的影響也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[4]。而PPAR-α抑制分化成熟的脂肪細(xì)胞糖酵解，減少丙酮酸和乳酸生成，抑制糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)；抑制葡萄糖的攝取[4]。這與在HepG2細(xì)胞中得到的結(jié)果完全不同。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞PPAR-γ和PPAR-α受體都有促進(jìn)糖代謝的作用，并且可不同程度地改善棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)葡萄糖攝取或糖酵解有關(guān)。關(guān)于PPAR-γ和PPAR-α在正常肝細(xì)胞糖代謝中的作用有待進(jìn)一步探討。

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